一组核苷酸序列及在嗜水气单胞菌鉴定中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DNA恒温扩增技术，尤其涉及一种嗜水气单胞菌的鉴定方法，属 于微生物快速鉴定领域。
【背景技术】
[0002] 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)是一种革兰阴性、能运动、兼性厌氧、氧化 酶阳性的杆状细菌，属于弧菌科、气单胞菌属。嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水 体，是多种水生动物的原发性致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病的病原菌。近年来大量研 宄表明，嗜水气单胞菌可单独或者与其他致病菌共同感染，引起人类肠胃炎、败血症以及外 伤引起软组织感染等病症，危害食品安全，并且是免疫缺陷病人和肝功能疾病患者的条件 致病菌，具有重要的公共卫生意义。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗和嗜水气单胞 菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的嗜水气单胞菌检测方法成为必要。
[0003] 虽然嗜水气单胞菌诱发肠胃炎的致病机理并未完全阐明，但研宄者已经对一些潜 在的毒力因子进行了深入的研宄。摄取铁离子与一些病原菌的毒力密切相关，人体中的亚 铁血红素是病原菌铁离子的一个重要来源，并且许多病原菌本身就具有亚铁血红素运输系 统，desA基因是编码嗜水气单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一，并且编码 一种外膜蛋白受体，可以从环境中摄取细菌生长和存活所必需的铁离子，因此是一个理想 的检测目的基因。
[0004] 目前对于嗜水气单胞菌分离鉴定主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法 耗时大约5天，包括增菌、选择培养及后续的生化鉴定，耗时耗力。生化结果的判读依赖于 人的主观判断，导致结果重复差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基 础的诊断技术（如普通PCR技术，荧光PCR技术）被用于嗜水气单胞菌的快速诊断，然而这 些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，较高的探针合成费用，以及熟练的操 作人员。一些基层实验室无法开展，限制了这些技术的运用。此外PCR检测技术的灵敏度 差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。随着恒温技术的出现，环介导恒温扩 增技术（LAMP)已经被用于很多病原菌的检测，然而该技术的引物设计复杂，对目的基因的 序列长度要求较长且保守性要求较高。因而，急需发展一种简单、快速、灵敏和特异的诊断 技术用于嗜水气单胞菌检测。
[0005] 交叉恒温扩增技术（Cross priming amplification，CPA)是由 Xu Gaolian 等建 立的一种新的恒温核酸扩增技术，具有灵敏高、操作简单、不依赖于昂贵设备、产物易检测 等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。CPA先在靶序列上设定5个任意序列4a、la、 3s、2s和5s，设计与之互补的5条引物，5条引物之中交叉引物为1条，即As，该交叉引物自 5'末端依次含有2a和Is片段，即5' -2a-ls ;置换引物为2条，即4s和5a ;扩增引物为2 条，即3a和2a。利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，靶序 列能够得以高效扩增。
[0006] CPA反应仅需恒温在62~66°C之间的一个温度即可，该温度是双链DNA复性及延 伸的中间温度，双链DNA在该温度范围内处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一 个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。CPA在 链置换Bst DNA聚合酶的作用下，以As引物Is区段的Y末端为起点，与对应的模板DNA 序列互补配对，启动链置换DNA合成。4s引物与模板片段4a互补结合，以3'末端为起点， 通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出As引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。 最终4s引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然而由As引物先合成的DNA链被4s 引物进行链置换产生一单链，该单链通过模板5'末端的3s区段和引物3a互补，启动DNA 合成；模板2s区段和引物2a互补，启动链置换DNA合成，释放含引物3a的DNA合成链，该合 成链能够与引物2a和As互补结合，启动第一个循环扩增。此外由引物2a互补合成的新链 能被下游的置换引物5a置换，产生的新链发生自我碱基配对，形成单一茎环状结构，启动 第二个循环扩增。CPA反应扩增的第一个循环阶段：形成的短链产物处于解链与结合动态 平衡，引物能够与解离的单链结合实现扩增循环；第二个循环阶段：在哑铃状结构中，As引 物中的Is与环上单链Ia杂交，启动新一轮链置换反应，扩增出短链DNA，形成的短链产物同 样处于解链与结合动态平衡，引物能够与解离的单链结合实现扩增，并产生新的茎环结构， 从而实现CPA的循环扩增。CPA反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内使 产物的量达到IO9个拷贝。
[0007] CPA扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法是 直接在反应体系中加入Loopamp荧光染料，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可 以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性 反应，无此现象的则为阴性反应。
[0008] 本发明的目的就是通过特异的引物设计，建立一种用于非诊断目的的嗜水气单胞 菌的方便、快速、特异、灵敏的CPA检测方法，以能够在基层实验室进行大规模的推广使用。
【发明内容】
[0009] 基于上述目的，本发明首先提供了一组用于交叉恒温扩增技术的核苷酸序列，所 述序列包括：含有如SEQ ID NO :6所示序列的核苷酸序列作为交叉引物，含有如SEQ ID NO: 3所示序列的核苷酸序列和含有如SEQ ID NO :4所示序列的核苷酸序列作为扩增引物，含 有如SEQ ID NO: 1所示序列的核苷酸序列和含有如SEQ ID NO :5所示序列的核苷酸序列作 为置换引物。
[0010] SEQ ID N0:l、3、4、5和6是根据嗜水气单胞菌desA基因作为模板基因设计出来 的。本发明的发明点在于上述5种序列能够与嗜水气单胞菌desA基因的特定区段进行特 异性的结合。含有上述针对desA基因具有特异性的5种序列的引物，例如对SEQ ID NO: 1、3、4、5和6的5'端和/或3'端的添加性修饰都能够实现本发明的目的，因此也都在本 发明的保护范围之内。
[0011] 在一个优选的实施方案中，所述序列包括：如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列作为 交叉引物，如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列作为扩 增引物，如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列作为置换 引物。
[0012] 其次，本发明还提供了应用上述序列组合进行交叉恒温扩增的方法，所述方法包 括如下步骤：
[0013] (1)将待检测样本、上述的5种序列作为引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO4、甜菜 碱以及交叉恒温扩增缓冲液加入到反应容器中；
[0014] (2)将步骤⑴所得的混合液放置于62~66°C之间的温度环境中进行DNA扩增 反应；
[0015] (3)检测步骤⑵获得的产物。
[0016] 优选地，步骤（1)中所述待检测样本为DNA提取物，待检测样本的来源可以为细菌 培养物、体液或人体分泌物样本。
[0017] 优选地，在步骤（1)的反应容器中的所述置换引物的浓度为0.3mM，所述交叉引物 的浓度为2. 4mM，所述扩增引物的浓度为I. 44mM。
[0018] 优选地，步骤（2)中所述的温度环境为65°C。
[0019] 优选地，步骤⑵中所述的DNA扩增反应时间为1小时，本领域技术人员可以根据 实际检测进度的需要对反应时间进行适当地调整，而不会影响实际的反应效率。
[0020] 优选地，步骤（3)所述的检测方法为电泳检测法、浊度检测法、或染色检测法。
[0021] 电泳检测法：扩增产物是一系列不同大小的DNA片段混合物，阳性产物为电泳后 在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，而阴性反应不出现条带。
[0022] 浊度检测法：CPA在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸根离子，它们能与镁离子 结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据反应体系中是否形成白色沉淀来定性判断CPA反应 是否发生。
[0023] 染色检测法：在反应体系中加入的Loopamp焚光染料是一种妈黄绿素螯合剂，在 反应起始，体系中的锰离子将钙黄绿素螯合，不发射荧光；反应结束后生成Mn2P2O7，释放出 钙黄绿素而发射荧光。呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。
[0024] 更为优选地，所述染色检测使用的染料为Loopamp荧光染料FD。
[0025] 第三，本发明还提供了一种用于检测嗜水气单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包括上 述的5种序列作为引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、MgSO4、以及恒温扩增缓冲液。本发 明提供的试剂盒可以应用常规的交叉恒温扩增技术的试剂和反应常数技术扩增。
[0026] 发明人建立了 CPA技术对嗜水气单胞菌的检测方法。通过对CPA检测和qPCR检 测进行比较，我们发现CPA检测无论在检测灵敏度上还是在对样本的检测能力上都与qPCR 相一致。但是qPCR技术的检测成本较高，需要精密昂贵的热循环仪器，且对实验环境和操 作者的技术也有严格的要求，因此限制了该技术的普遍适用性，不利于在农村地区以及基 层实验室的推广应用。而CPA技术设备简单，易操作，其反应只需要一个普通的水浴锅或者 恒温装置，不需要昂贵的PCR仪，易于在基层实验室和农村地区推广应用。一般情况下，以 分子水平为基础的检测方法例如PCR和qPCR都会受临床标本中抑制物的影响，一些研宄者 报导CPA使用的Bst聚合酶对样品中抑制物的耐受能力比qPCR中的Taq酶要强，因此CPA 技术具有更广阔的临床应用前景。
[0027] 总之，本研宄建立的CPA方法是首次将CPA技术运用到了嗜水气单胞菌的检测，该 方法在Ih内就可以观察结果，满足了临床快速诊断的需要。在以常见的致病菌及条件致病 菌DNA为模板评价CPA反应体系的特异性的实验中，该体系在检测33种其他常见致病菌和 机会致病菌时未出现特异性扩增，说明该检测体系的特异性良好。CPA方法扩增反应条件简 单，温度单一、反应及结果研判快速，所需仪器设备简单，可作为一种快速的筛查方法在临 床检验检疫、基层实验室及农村地区进行大规模的推广使用。
【附图说明】
[0028] 图I. CPA检测desA基因的引物设计位置和方向不意图；
[0029] 图2. CPA对质粒标准品检测的灵敏度评价浊度分析图；
[0030] 图3. CPA对质粒标准品检测的灵敏度评价电泳分析图；
[0031] 图4. CPA对质粒标准品检测的灵敏度评价焚光目测图；
[0032] 图5. CPA对模拟标本检测的灵敏度评价浊度分析图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0034] 本发明实施例所用标准菌株购自中国药品生物制品检定所，其他菌株分离自食 品、粪便和呕吐物等样品，均经德灵WALKAWAY-40SI全自动微生物分析仪鉴定。用于特异性 评价的菌株见表2。
[0035] 序列设计
[0036] 根据嗜水气单胞菌特异性基因 desA设计交叉反应引物。desA基因编码一种外膜 蛋白受体，可以从环境中摄取细菌生长和存活所必需的铁元素。我们利用多序列比对软件 ClustalX 1. 83对嗜水气单胞菌的参考菌株进行desA基因的序列比对，在该基因的保守区 域使用引物设计软件Primer Premier 5.0设计交叉反应引物，并将设计的引物在NCBI数 据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能