一种大环内酰胺类化合物heronamides的生物合成基因簇及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种大环内酰胺类化合物 heronamides的生物合成基因簇及其应用。
【背景技术】
[0002] Heronamides属于二十元环大环内酰胺类化合物，目前鉴定的6个天然产物都是 从海洋放线菌中分离得到，最近的研宄表明hernamides可以特异性的与细胞膜结合，诱导 非正常细胞的形成。另外hernamides还具有独特的分子内成环结构和不饱和的侧链基团， 其生物合成机制目前还没有研宄清楚。
[0003] 近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术，为改造 heronamides的生产菌--深 海放线菌（Streptomyces sp.) SCSIO 03032带来了新的机遇。在理解自然界聚酮化合物 天然组合生物合成机理的基础上，人们可以采用组合生物合成技术对抗生素的生物合成基 因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作，不但能够生产"非天然"的天然产物 结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物 的发现和药物开发提供化合物结构和生物活性多样化。迄今为止，有关大环内酰胺类化 合物heronamides的生物合成基因簇、P450氧化酶等生物催化制备大环内酰胺类化合物 heronamides方面的研宄，国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种大环内酰胺类化合物heronamides的生物合成基因簇。
[0005] 本发明是以印度洋深海沉积物来源放线菌中二十元环大环内酰胺类化合物 heronamides为目标分子，在筛选到生物合成基因簇的基础上，综合运用分子生物学、微生 物学、合成生物学、生物化学以及有机化学相结合的技术，阐述了 heronamides的生物合成 机制，为利用组合生物合成方法修饰改造 heronamides类化合物提供依据，为药物筛选提 供化合物实体。
[0006] 本发明的heronamides生物合成基因簇来源于印度洋深海沉积物放线菌 Streptomyces sp. SCSIO 03032,其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第2662-82562位的碱基序列所示，包含20个基因，具体为：
[0007] 1)大环内酰胺骨架合成基因，即 herAl、herA2、herB、herC、herD、herE、herF、herG 共8个基因：
[0008] herAl位于基因簇核苷酸序列第65521-79383个碱基处，长度为13863位碱基，编 码聚酮合成酶，4620个氨基酸；
[0009] herA2位于基因簇核苷酸序列第79416-82562个碱基处，长度为3147位碱基，编码 聚酮合成酶，1048个氨基酸；
[0010] herB位于基因簇核苷酸序列第6446-17113个碱基处，长度为10668位碱基，编码 聚酮合成酶，3555个氨基酸；
[0011] herC位于基因簇核苷酸序列第3771-5855个碱基处，长度为2085位碱基，编码聚 酮合成酶，694个氨基酸；
[0012] herD位于基因簇核苷酸序列第25639-35769位碱基处，长度为10131个碱基，编码 聚酮合成酶，3376个氨基酸；
[0013] herE位于基因簇核苷酸序列第53050-57999位碱基处，长度为4950个碱基，编码 聚酮合成酶，1649个氨基酸；
[0014] herF位于基因簇核苷酸序列第42833-53002位碱基处，长度为10170个碱基，编码 聚酮合成酶，3389个氨基酸；
[0015] herG位于基因簇核苷酸序列第36832-42825位碱基处，长度为5994个碱基，编码 聚酮合成酶，1997个氨基酸；
[0016] 2)负责β -氨基引入基因 herI、herU :
[0017] herl位于基因簇核苷酸序列第2662-3774位碱基处，长度为1113个碱基，编码甘 氨酸氧化酶，370个氨基酸；
[0018] herU位于基因簇核苷酸序列第5886-6449位碱基处，长度为564个碱基，编码硫酯 酶，187个氨基酸；
[0019] 3)负责氨基保护/去保护基因，即herj、herK、herL、herP、herS共5个基因：
[0020] herj位于基因簇核苷酸序列第17201-18799个碱基处，长度为1599个碱基，编码 乙酰辅酶A连接酶，532个氨基酸；
[0021] herK位于基因簇核苷酸序列第19157-20098位碱基处，长度为942个碱基，编码酰 基转移酶，313个氨基酸；
[0022] herL位于基因簇核苷酸序列第20468-21982位碱基处，长度为1515个碱基，编码 腺苷化结构域，504个氨基酸；
[0023] herP位于基因簇核苷酸序列第35777-36712位碱基处，长度为936个碱基，编码氨 基肽酶，311个氨基酸；
[0024] herS位于基因簇核苷酸序列第20113-20349位碱基处，长度为237个碱基，编码肽 酰转运蛋白，78个氨基酸；
[0025] 4) P450 氧化酶基因 HerO :
[0026] herO位于基因簇核苷酸序列第24299-25546位碱基处，长度为1248个碱基，编码 P450单加氧酶，415个氨基酸；
[0027] 5)调控和转运基因，即1^1^、116滷、116冰、116冰共4个基因：
[0028] herH位于基因簇核苷酸序列第62052-64952位碱基处，长度为2901个碱基，编码 转录调控因子，966个氨基酸；
[0029] herM位于基因簇核苷酸序列第21965-22561位碱基处，长度为597个碱基，编码转 录调控因子，198个氨基酸；
[0030] herN位于基因簇核苷酸序列第22663-24225位碱基处，长度为1563个碱基，编码 分泌蛋白，520个氨基酸；
[0031] herR位于基因簇核苷酸序列第58504-61344位碱基处，长度为2841个碱基，编码 转录调控因子，946个氨基酸；
[0032] SEQ ID NO. 1所示序列的第2662-82562位碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互 补原则随时得到，且第2662-82562位的碱基序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式 反应（PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应DNA或DNA重组技术获得。本发明提供了构 建至少包含部分SEQ ID NO. 1所示序列的第2662-82562位中DNA片段的重组DNA载体途 径。
[0033] 本发明还提供了 heronamides生物合成基因被中断或其他基因改造的途径，至少 其中之一的基因包含有SEQ ID NO. 1的第2662-82562位中的核苷酸序列。
[0034] 本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可使用PCR探针法或Southern杂 交等技术，从其他生物体重筛选获得heronamides生物合成基因簇同源基因。
[0035] 本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可用于Streptomyces sp. SCSIO 03032基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包括本发明中的部分序列，也 包含Str印tomyces sp.SCSIO 03032基因组中邻近区域未克隆DNA。
[0036] 包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段，可以被体内 外突变等修饰，包括插入、置换、缺失、易错聚合酶链式反应、位点特异性突变、不同序列重 组、定向进化等。
[0037] 包含本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆，可以通过合适表达系 统在外源宿主中表达生产相应酶或者提高生物活性化合物产量。这些外源宿主包括大肠杆 菌、链霉菌、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母及动植物等。
[0038] 本发明提供的氨基酸序列可以用于分离所需蛋白并可用于抗体制备。
[0039] 包含本发明所提供的氨基酸序列或者部分序列的多肽，可能在去除或者替代某些 氨基酸之后仍有生物活性甚至新的生物活性，或提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其 他致力于得到的性质。
[0040] 包含本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源 宿主中表达及揭示它们在宿主代谢中的功能。
[0041] 包含本发明所提供核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过DNA 重组技术构建重组载体，以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活，进 而获得其他基于生物合成途径的新结构化合物。
[0042] 本发明提供了 heronamides生物合成基因簇在制备heronamides及其类似物中的 应用。
[0043] 本发明所提供的P450氧化酶HerO为P450单加氧酶，可用于heronamides的结构 中8位碳的羟基化，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第24299-25546位碱基所示。
[0044] 本发明提供了 P450氧化酶基因 HerO缺失突变株中累积制备中间体heronamide G 的应用，P450氧化酶HerO在体外生化法催化heronamide G制备heronamid F中的应用。
[0045] 总之本发明所提供的包括heronamides合成相关的所有基因和蛋白信息，帮助人 们理解二十元环大环内酰胺类天然产物的氨基形成、内部成环等关键机制，为进一步遗传 改造提供材料和理论基础。本发明所提供的基因和蛋白质可以用来寻找和发现可用于医 药、卫生或农业的heronamides类化合物、基因或蛋白。
[0046] 本发明的链霉菌（Streptomyces sp. ) SCSIO 03032于2011年7月18日保藏于 中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO: M 2011258,其公开于专利号为：ZL201210087537. 7,发明名称为：链霉菌、抗肿瘤化合物 Spiro-Indimycin A-D及其制备方法和应用的