一种硼酸介导的聚合酶链反应检测dna中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，具体是一种快速、准确、高效检测和定位特定基因 /片段中5-羟甲基胞嘧啶的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 5_ 轻甲基胞啼陡（5_hyd;roxymethylcytosine，5hmC)是继 5_ 甲基胞啼陡 (5-methylcytosine，5mC)之后发现的第六种碱基，已在多种哺乳动物组织和细胞中检出。 与5mC相比，5hmC的含量更低（2009年，Heintz研究组利用薄层色谱和质谱等分析方法， 在人、小鼠大脑以及胚胎干细胞中检测到5hmC，皮质和脑干区5hmC表达丰富，浦肯野细胞 中5hmC的含量约占总核苷酸的0. 6%，在颗粒细胞中约占0. 2% ;S. Kriaucionis，N. Heintz, Science，2009, 324 :929-930),但5hmC也同样具有非常重要的生物学功能。
[0003] 现有的研究已经表明5hmC和TETs参与了基因组重新编程、基因表达的转录调 控，并在DNA去甲基化过程中发挥重要作用。2011年，研究发现TET蛋白可将5hmC转 变成 5_ 甲醜胞啼陡（5-formylcytosine，5fC)和 5_ 羧基胞啼陡（5-carboxylcytosine， 5caC)。此两种碱基修饰产物都可以在基因组DNA中检测到，并且5hmC、5fC和5caC的基 因组含量与TET蛋白的表达量有关。5fC和5caC的发现提示了一种新的主动去甲基化通 路（5mC - 5hmC - 5caC - C)，为研究DNA去甲基化作用及生理功能指明了方向。5mC首先 氧化为 5hmC，并进一步氧化为 5fC 和 5caC (S. Ito, L Shen，Q. Dai，S. C Wu，L Collins， J. A. Swenberg，C. He，Y. Zhang，Science，2011，333 :1300-1303)。而 5fC 和 5caC 可被一种 重要的胸腺嘧啶DNA糖基化酶（Thymine DNA Glycosylase，TDG)识别并切除，形成非碱基 位点，最后通过碱基切除修复通路将非碱基位点修复为正常的胞嘧啶。令人感到意外的是， DNA修复通路不仅负责细胞内的DNA损伤的消除而且参与DNA主动去甲基化。再次证明了 DNA 修复的重要性（Y. F. He，B. Z. Li, Z. Li, P. Liu，Y. Wang，C. He，G. L. Xu，et al.，Science， 2011,333 :1303-1307)。另外，Xu研究组发现TETs蛋白家族中的TET3在卵细胞重新编程 过程中也起到了重要作用（Τ· P. Gu，F. Guo, H. Yang，G. L. Xu，Nature，2011，477 :606-U136); 目前，大量的研究显示5hmC是5mC在去甲基化过程中的一种重要的中间体，实际上，基因组 中5hmC含量较低，与推断其是一种短暂产生的中间体是相一致的。另外，5hmC在基因调控 元件区具有独特的分布特点，研究发现5hmC和5mC都高度富集于基因内部，尤其是外显子 区，只有5hmC在转录起始位点、5'非编码区富集，在其他基因转录调控元件区如增强子、启 动子区域等5hmC表达水平较5mC相对高。综上，5hmC的生物学功能还不是很明确，但是可 以确定的是5hmC和TETs在全基因组的表观遗传重组和组织特异性基因表达的调控中起到 了非常重要的作用。另外，5hmC可能与特定肿瘤的发生密切相关，有可能成为肿瘤早期诊断 的生物标志物。
[0004] 对5hmC生物学功能的研究离不开高灵敏度、高特异性、高通量的检测方法。相对 于基因组中含量较高的5mC，5hmC含量较低，且两者结构相似，导致传统的用于5mC的检测 方法不能应用于5hmC的检测分析。例如，经典的重亚硫酸盐测序法。基因组DNA经重亚硫 酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶可通过脱氨基和脱磺酸基作用转化为尿嘧啶（U)，再经聚合 酶链反应（PCR)扩增转变成胸腺嘧啶（T)，而5mC经处理后不能转化为胞嘧啶（C)，PCR扩增 后仍为C，从而可将5mC与未修饰的C区分。但是，5hmC由于不能脱氨基而形成5-亚甲基 磺酸胞嘧啶，在重亚硫酸盐测序中5hmC和5mC都不能脱氨基，从而PCR扩增后二者不能产 生序列差异，即5mC和5hmC不能被区分。
[0005] 基因水平5hmC的检测方法更是多种多样，以目前已经发展成为5hmC检测试剂盒 的限制性内切酶酶解结合PCR技术为例，首先采用T4噬菌体β -葡萄糖转移酶（Τ4β -GT)， 在葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glu)存在下，将葡萄糖基团转移至羟基位置， 从而生成葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶（5ghmC)，使5hmC与胞嘧啶（C)、5mC完全区分开。在 此基础上,进行限制性内切酶MspI酶解，由于葡萄糖基化反应后改变了此种限制性内切酶 的酶切特性，使得含有5ghmC位点的序列在酶解之后得以保留，不含有5hmC位点的序列被 酶解掉；通过PCR技术将保留序列进行扩增，从而达到特定基因水平检测5hmC的目的。该 检测试剂盒受到了酶切位点的限制，即5ghmC位点必须位于酶切位点上才能够被检测，且 不能区分多位点的基因序列。
[0006] 综上，发展5hmC的特异性检测方法以及相关的快速、准确检测试剂盒成了目前亟 须解决的问题，对于5hmC在基因组中分布特点研究，以及对其生理学功能的深入探讨具有 十分重要的意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种新的更有效和简便的检测特定基因/片段中5hmC的 方法和试剂盒。其检测结果为5hmC生物学功能研究，以及相关癌症发病机理研究提供科学 依据。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种检测特定基因/片段中5hmC的方法，包括下列步 骤：
[0009] 1.利用葡萄糖基化反应，将基因组DNA中5hmC转化成5ghmC，从而与5mC以及C 相区分；
[0010] 2.利用硼酸或其衍生物试剂和葡萄糖基邻位二醇之间的反应，引入阻碍DNA复制 的基团，从而来抑制特定基因序列片段正常的PCR扩增，使PCR产率降低；另外，在葡萄糖基 化反应基础上，不添加硼酸或其衍生物试剂，则特定基因/片段是正常的PCR扩增，从而在 基因水平实现了对5ghmC的选择性识别；此过程采用实时荧光定量PCR技术检测硼酸或其 衍生物试剂对DNA复制过程的影响（附图1)。
[0011] 在一个优选例中，所述的基因组DNA需经过紫外分光光度计测定浓度（0D260/280 比值在1. 8-2. 0范围内）和电泳检测(一条清晰的电泳条带，无明显拖尾）完整性。
[0012] 在另一个优选例中，所述的实时荧光定量PCR反应程序包括：起始95°C预变性2 分钟；循环程序：95°C变性15秒，57°C退火15秒，25°C延伸60秒，共40个循环。
[0013] 在本发明的第二方面，提供一种检测特定基因/片段中5hmC的试剂盒，包括葡萄 糖基化反应试剂、硼酸试剂、实时荧光定量PCR反应试剂、阳性对照探针和阴性对照探针。
[0014] 在另一个优选例中，所述的葡糖糖基化反应试剂包括：T4噬菌体β -葡萄糖转移 酶、葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖、缓冲溶液。
[0015] 在另一个优选例中，所述的硼酸试剂包括硼酸、苯硼酸、3-氯苯基硼酸、2- (2'_氯 苄氧基）苯基硼酸、3-(单磺酰胺）苯硼酸以及其他可与邻二醇作用的硼酸类衍生物试剂。
[0016] 在另一个优选例中，所述的实时荧光定量PCR反应试剂包括： 2 X GoTaqK qPCR Master Mix，其中含有GoTaqK热启动DNA聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、 氯化镁、反应缓冲液、荧光染料SYBRRGreen I。
[0017] 在另一个优选例中，所述的阳性对照探针是在距离5'端第58位含有一个5ghmC 位点长度为100个核苷酸的寡核苷酸双链（5ghmC-dS100mer)。
[0018] 在另一个优选例中，所述的阴性对照探针是无任何修饰位点或在距 离5 '端第58位含有一个5mC或5hmC位点长度为100个核苷酸的寡核苷酸双链 (C/5mC/5hmC_dsIOOmer)。
[0019] 在本发明的第三方面，提供一种特异性识别5hmC的方法及试剂盒的用途。与传统 的检测试剂盒相比，该方法不受酶切位点限制，可适用于各种细胞或组织的DNA或RNA不同 序列基因5hmC的分析鉴定；进一步应用于阐明5hmC在基因组重新编程、基因表达的转录调 控、DNA去甲基化、肿瘤形成以及诸多未知领域的生物学功能研究。
[0020] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0021] 图1为硼酸介导的聚合酶链反应检测5hmC技术原理图(灰色小球代表硼酸衍生物 试剂的不同取代基团）；
[0022] 图2为阳性对照探针（5ghmC_dsIOOmer )和阴性对照探针（5hmC_dsIOOmer )的 UHPLC-MS/MS分析质谱图（检测5hmdC和5ghmdC的特征离子对分别为m/z258. 2 - 142. 1 (a)和 m/z420. 2 - 304. I (b));
[0023] 图3为在阳性对照探针（5ghmC-dsIOOmer )扩增中，硼酸可特异性抑制