检测braf基因突变的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别是涉及一种检测BRAF基 因突变的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌发病率逐年增高，晚期及术后复发患者需要生物靶向治疗。美国FDA 及我国结直肠癌术后治疗方案中明确指出，在进行一线和二线化疗方案实施中，拟加入靶 向EGFR受体抗体靶向药物(西妥昔单抗和帕尼单抗）时，需进行药敏基因突变检测。国 际大样本多中心研究表明，同时进行KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因突变检测，并按此顺 序串联诊断，可最大限度地准确预测患者对于抗体靶向药物的敏感性(参见文献Roock WDjClaes BjBernasconi D et al. Effects of KRAS, BRAFj NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol，2010, 11:753-62.)。
[0003] 目前针对BRAF基因突变的检测方法主要有：直接测序法（Direct Sequencing)、 高分辨率溶解曲线分析技术（high resolution melting analysis，HRM)和扩增阻滞突 变系统技术（amplification refractory mutation system，ARMS)。直接测序法（Direct Sequencing)以PCR扩增技术为核心，其灵敏度较低大于10%，有碍其临床广泛应用（参 考文献 Lynch Tj Bell D，Sordella R，et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non - small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med，2004, 350 (21) :2129-2139. Paez J，Janne P，Lee J，et al. EGFR mutations in lung cancer:Correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science，2004, 304 (4) : 1497-1500.)。高分辨率溶解曲线分析技术 (high resolution melting analysis，HRM)是利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列 溶解曲线不同的原理，在PCR扩增后根据扩增产物的熔点不同完成对样品突变分析，其灵 敏度可达1%，但需要高灵敏度的精密Q-PCR仪，多用于研究中，限制了其临床应用（参考文 献 Li LHj Tze KEj Chih CCj et al. Characteristics and prevalence of KRAS, BRAFj and PIK3CA mutations in colorectal ancer by high-resolution melting analysis in Taiwanese population. Clinica Chimica Acta，413 (2012) 1605 - 1611) ?扩增阻滞突变 系统技术（amplification refractory mutation system，ARMS)是设计引物 3'端序列 分别野生和突变互补，针对突变的等位基因进行特异性扩增和鉴定。另外Scorpions为 蝎形结构的特异性探针，包含一个与Y端共价相连的PCR引物，引物仅仅识别突变序 列，而不识别正常序列，在即时PCR反应中，当探针与扩增子（即突变序列）连接进行扩增 时，荧光基团与淬灭基团分离，反应试剂中荧光度增强。Scorpions与ARMS技术联和应 用（SARMS)可检测单个突变，对于已知基因的检测，SARMS具有高度的敏感性0.1%。该方 法的缺点是：1)每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定；2)可能 出现由于单一碱基错配造成的假阳性。该方法主要用于各类组织，包括手术、穿刺或镜 检组织类，2小时即可完成检测，试剂盒商业化程度高，临床认可程度高，国内已有试剂盒 获 SFDA 生产批文【参考文献 Newton CR，Graham A，Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA: the amplification refractory mutation system(ARMS). Nucleic Acids Res, 1989, 17(7):2503-2516. Marcin M. Machnicki, Eliza GM1Tomasz L, et al. ARMS-PCR for detection of BRAF V600E hotspot mutation in comparison with Real-Time PCR-based techniques. ACTA BIOCHIMICA POLONICA, VoI. 60, Nol/2013:57 - 64.Fox JC, et al. The detection of K~ras mutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system, Br J Cancerl998;77:1267-74. ]〇
[0004] 肽核酸是一种DNA类似物，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯 糖，其较之传统DNA探针具有不少优点：1) PNA十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性 远远高于相应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物，亦不会被 其他酶所降解。2)对于错配的PNA/DNA，哪怕只有一个碱基的错配，也会造成其融解温度 下降9 一 KTC左右。目前，肽核酸作为一种非常有用分子生物学工具已在疾病的诊断、 治疗等领域得到应用（参见文献：张兵波等，PNA探针与DNA探针的系统比较A Systemic Comparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通报》2006 ;9 :62-68 ;Egholm M， et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules，Nature, 1993, 365:566 ~568.)。韩国 PANAGENE 公司和美国 PNA Bio Inc.公司均应用PNA作为钳制探针，阻遏野生DNA序列的扩增，使突变序列得以扩增检 测，用于突变序列的筛查，研制了 BRAF突变检测试剂盒，但这些检测方法不能准确检出突 变类型，且受到不同突变类型之间的交叉干扰。
[0005] 针对BRAFV600位点，Cosmic网站发布突变类型和频率如下表1所示。
[0006] 表1Cosmic网站发布的BRAFV600突变类型及频率
[0007]
[0008] 目前国际临床研究进行BRAF突变检测多集中于高频出现的V600E和V600K，其具 有肿瘤诊断和指导靶向用药的临床意义，且已大量临床实验证实，而对于其他突变类型(如 V600D，V600_K601>E，V600M和V600R)的临床意义目前无准确报道。
[0009] 综上所述，BRAF高频出现的V600E和V600K突变具有临床诊断意义，但目前报道 的高灵敏度的PCR检测方法，缺乏一定特异性、灵敏性及准确性。
【发明内容】
[0010] 本发明要解决的技术问题是提供一种高灵敏度和高特异度的检测BRAF基因第15 号外显子（exonl5)突变（V600E和V600K)的方法及其试剂盒。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供一对用于检测BRAF基因第15号外 显子突变V600E和V600K的引物对，包括：
[0012] 1)如SEQ ID NO. 1所示的上游序列和如SEQ ID NO. 2所示的下游序列；或者
[0013] 2)至少与SEQ ID NO. 1所示的上游序列80%相同的序列和至少与SEQ ID NO. 2所 示的下游序列80%相同的序列。
[0014] 本发明的第二方面，提供一种用于检测野生型BRAF基因的探针，包括：包含SEQ ID NO. 3所示序列的探针（Probel野生)。
[0015] 其中，所述探针（Probel野生）的两端还分别标记有荧光报告基团(包括：FAM、 ViC、NED、Cy3、Cy5、J0E、TEXASRED 或 TAMRA 等）和荧光淬灭基团（包括：MGB (minor groove binder)或TAMRA)。如该探针可为一种Taqman-MGB探针。
[0016] 本发明的第三方面，提供一种用于检测BRAF基因第15号外显子突变V600E的探 针，包括：包含SEQID NO. 4所示序列的探针（Probe2突变El )、包含SEQ ID NO. 5所示序列 的探针（Probe3突变E2)或包含SEQ ID NO. 6所示序列的探针（Probe2突变E1E2)。
[0017] 其中，所述用于检测BRAF基因第15号外显子突变V600E的探针的两端还可分别 标记有荧光报告基团(包括：FAM、ViC、NED、Cy3、Cy5、JOE、TEXASRED或TAMRA等）和荧光淬 灭基团（包括：MGB (minor groove binder)或TAMRA)。如该探针可为一种Taqman-MGB探 针。
[0018] 本发明的第四方面，提供一种用于检测BRAF基因第15号外显子突变V600E的PNA (联合肽核酸）阻遏序列，包括：SEQ ID NO. 7所示的PNA阻遏序列（PNA-NBN-W)或SEQ ID NO. 8所示的PNA阻遏序列（PNA-HNN-K);
[0019] SEQ ID NO. 7 ：TTGGTCTAGCTACANBNAAATC ;其中，M 表示 A、C、G 或 T，S 表示 C、G 或 τ，如选自以下组合：
[0020] ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、ATA、ATT、ATC、ATG、TCA、TCT、TCC、TCG、 TGA、TGT、TGC、TGG、TTA、TTT、TTC、TTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC、GGG、GTA、GTT、 GTC、GTG*、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、CTA、CTT、CTC 或者 CTG ;主要封闭 了野生 型 V600 (GTG)、突变 V600M (ATG)和突变 V600R (AGG)。
[0021] 其中，AGG、ATG、GTG*为已报道存在的野生或突变序列，参照上述Cosmic网站发布 突变类型，加*为独特封闭的序列。
[0022] SEQ ID NO. 8 ：TTGGTCTAGCTACAHNNAAATC ;其中，H 表示 A、C 或 T，M 表示 A、C、G 或 T，如 H塑选自以下组合：AAA、AAT、AAC、AAG*、ATA、ATT、ATC、ATG、AGA、AGT、AGC、AGG、ACA、 ACT、ACC、ACG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTT、CTC、CTG、CGA、CGT、CGC、CGG、CCA、CCT、CCC、 CCG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TTG、TGA、TGT、TGC、TGG、TCA、TCT、TCC 或者 TCG ;主 要封闭了突变 V600K (AAG)、突变 V600M (ATG)和突变 V600R (AGG)。
[0023] 其中，AAG*、ATG、AGG为已报道