油茶良种长林18号和21号的特异性标记引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及油茶良种长林18号和长林21号的分子特异性标记引物及其鉴定方 法。 (二）
【背景技术】
[0002] 油茶是我国栽植面积最大、分布范围较广的木本油料树种。大力发展油茶产业，对 保障粮油安全，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农村，都具有十分重要 的意义。我国油茶产业方兴未艾，发展潜力巨大。目前，我国油茶林总面积达4500多万亩， 但产量很低，每亩产茶油仅4公斤左右。其根本原因是，绝大部分油茶林品种品质差或严重 退化，而大量的国家和省级审（认）定的优良品种又未推广应用。同时，一些地方种苗质量 意识淡薄，经营管理粗放。为保障油茶产业又好又快发展，要充分认识油茶良种对发展油茶 产业的重要性，必须加快油茶优良种苗发展和强化质量管理。
[0003] 我国目前对油茶种苗质量的监督管理，主要依靠在管理层面制定的各项制度，而 在技术层面尚未取得关键性突破，特别是缺乏油茶良种的早期快速鉴别技术体系。目前通 过国家林木良种审定的12个长林品种系列分别为长林3号、长林4号、长林18号、长林21 号、长林23号、长林26号、长林27号、长林40号、长林53号、长林55号、长林56号、长林 166号。这些油茶良种具有早实丰产、稳产、出籽率高、含油量高、抗性强、适应性广等特点。 对油茶种苗质量的监督管理要着力解决目前生产上油茶种苗的混乱局面，并首先从技术层 面上对长林油茶良种进行鉴别保护。
[0004] 目前对油茶品种的鉴别主要依据表观特征，但由于许多形态性状鉴定的周期 长、受环境影响大，并且品种数量不断增多，使得品种鉴定愈来愈困难。自本世纪以来， 一些基于PCR的分子标记技术如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增 多态性DNA)、ISSR(Inter_Simple Sequence Repea，简单序列重复区间扩增多态性）和 SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性）相继用于了油 茶的种质资源遗传多样性、遗传距离研宄，但对于分子标记与油茶性状的连锁、油茶品种间 的分子鉴别研宄很少。况且，这些分子标记技术所采用的均为通用引物，其PCR扩增图谱不 仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此并不适合用于品种鉴别，只有开发出某个品种稳 定、特异的DNA指纹标记才能真正用于该品种的准确快速鉴定。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的提供一对特异性高的油茶良种长林18号和长林21号的分子特异性标 记引物，以及一种能对油茶良种长林长林18号和长林21号进行快速鉴定的方法。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 油茶良种长林18号和长林21号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：
[0008] 上游引物：5，-CTCAAGGCTTCACTAACAGCAA-3，，
[0009] 下游引物：5' -CTGCCTCTCAATCTTGTTCACC-3'。
[0010] 该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得油茶良种长林18号和长林21 号的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物， 以该引物对油茶良种进行PCR扩增，仅长林18号和长林21号可稳定获得655bp大小的特 异性片段，而其他油茶品种均不能获得该特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标 记引物仅限于油茶良种的鉴别（鉴别其是否为长林18号或长林21号之一，后续再进行进 一步鉴定），即待测样品仅限于油茶。
[0011] 本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对油茶良种长林18号和长林 21号进行快速鉴别的方法，所述方法为：提取待测油茶品种叶片的基因组DNA作为模板，以 所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳 结果出现655bp大小的DNA条带，则待测油茶品种为油茶良种长林18号或长林21号，反之 则否；所述分子特异性标记引物序列为：
[0012] 上游引物：5，-CTCAAGGCTTCACTAACAGCAA-3，，
[0013] 下游引物：5' -CTGCCTCTCAATCTTGTTCACC-3'。
[0014] 本发明方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定， 以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
[0015] 优选的，本发明所述20 μ L PCR反应体系组成如下：
[0016]
[0017] 所述PCR扩增条件如下：94°C预变性7min ;94°C变性45min、60. 5°C退火45s、72°C 延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
[0018] 具体的，所述方法如下：
[0019] (1)取待测油茶叶片，加液氮磨碎，提取待测油茶的基因组DNA ;所述基因组DNA提 取可利用新型快速植物基因组DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公 司）进行；
[0020] (2)以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引 物，进行PCR扩增：
[0021] PCR反应体系每20 μ L组成如下：
[0022]
[0023] PCR反应条件如下：
[0024] 94°C预变性 7min ;94°C变性 45min、60. 5°C退火 45s、72°C延伸 2min，共 30 个循环； 最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
[0025] (3)取步骤⑵扩增产物5 μ L，与1 μ L 0. 25 %溴酚兰缓冲液混勾，点样于1. 5 % 的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶 图像分析仪上照相，若电泳结果出现655bp的DNA条带，则待测油茶品种为长林18号或长 林21号，反之则否。
[0026] 本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对油茶良种长林18 号和长林21号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不 能替代的分子手段。 (四）
【附图说明】
[0027] 图1为对油茶良种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；编号3和4分别为 长林18号和长林21号，扩增出了分子量为655bp的特异DNA条带；其余编号为其它的长林 油茶良种，未见有600bp多大小的特异DNA条带产生。 (五）
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0029] 实施例1 :
[0030] (1)油茶良种基因组DNA的提取：
[0031] 取待测油茶良种幼嫩叶片0. 03g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取利用新型快 速植物基因组DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司），提取获得油 茶良种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物通过1. 5 %的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光 光度计（Nanodrop Technologies，USA)来检测完整性、纯度及浓度。0D26(i/0D28(i>L8 的 DNA 样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20°C冰箱贮藏备用。
[0032] (2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：
[0033] 上游引物：5' -CTCAAGGCTTCACTAACAGCAA-3'和下游引物：5' -CTGCCTCTCAATCT TGTTCACC-3'，由上海生物工程技术有限公司合成。
[0034] (3) PCR 扩增：
[0035] PCR反应液组成：2 X Power Taq PCR Master Mix (PR1700，BioTeke，北京百泰克生 物技术有限公司）1〇 μ L，10 μ M上下游特异引物对各1 μ L，20ng/μ L模板DNA 3 μ L，CldH2O 5 μ L0
[0036] 扩增反应在Life ECO型扩增仪（Bioer，杭州博日科技有限公司）上进行。
[0037] 扩增条件：
[0038] 94°C 预变性 7min;
[0039] 94°C变性 45min、60.5°C退火 45s、72°C延伸 2min，共 30 个循环；
[0040] 最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
[0041] (4)电泳检测：取步骤（3) PCR扩增产物5 yL，与I yL 0. 25 %溴酚兰缓冲液混匀， 点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含 O.Syg/mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在美国伯乐自动凝胶图像分析仪（Chemi Doc XRS imaging system，Bi〇-Rad，Hercules，CA，USA)上照相。
[0042] 按照上述方法，分别对多个油茶良种（编号I~12代表油茶良种依次为：1 :长林3 号、2 :长林4号、3 :长林18号、4 :长林21号、5 :长林23号、6 :长林26号、7 :长林27号、8 : 长林40号、9 :长林53号、10 :长林55号、11 :长林56号、12 :长林166号）的特异引物PCR 扩增图谱进行电泳检测，结果见图1。
[0043] 图中箭头所指为仅从编号分别为3和4的油茶良种长林18号和21号中扩增出了 一条清晰明亮、稳定的分子量约为600bp多大小的特异DNA条带，而其余编号的油茶良种， 未见有600bp多大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明分子特 异性标记引物用于油茶良种长林18号和长林21号的鉴别，其稳定性、特异性非常高。
【主权项】
1. 油茶良种长林18号和长林21号的分子特异性标记引物，所述引物序列如下： 上游引物；5' -CTCAAGGCTTCACTAACAGCAA-3'， 下游引物；5' -CTGCCTCTCAATCTTGTTCACC-3'。2. -种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对油茶良种长林18号和长林21 号进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测油茶品种叶片的基因组DNA作为模板，W所 述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结 果出现65化P的特异DNA条带，则待测油茶品种为油茶良种长林18号或长林21号，反之则 否；所述分子特异性标记引物序列为： 上游引物；5' -CTCAAGGCTTCACTAACAGCAA-3'， 下游引物；5' -CTGCCTCTCAATCTTGTTCACC-3'。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下；94°C预变性7min; 94°C变性45min、60. 5°C退火45s、72°C延伸2min，共30个循环；最后于72°C补平7min，终 止温度为4°C。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1)取待测油茶叶片，加液氮磨碎，提取待测油茶叶片的基因组DNA; 似W步骤（1)提取的基因组DNA为模板，W所述分子特异性标记引物作为扩增引物， 进行PCR扩增： PCR反应体系每20yL组成如下；PCR反应条件如下； 94°C预变性7min;94°C变性45min、60. 5°C退火45s、72°C延伸2min，共30个循环；最后 于72°C补平7min，终止温度为4°C; (3)取步骤（2)扩增产物5yL与1yL0. 25 %漠酪兰缓冲液混匀，点样于1. 5%的琼脂 糖凝胶上，于1XTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后邸染色，于自动凝胶图像分 析仪上照相，若电泳结果出现655bp的DNA条带，则待测油茶品种为长林18号或长林21号， 反之则否。
【专利摘要】本发明涉及一对特异性高的油茶良种长林18号和长林21号的分子特异性标记引物，以及一种能对油茶良种长林18号和长林21号进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-CTCAAGGCTTCACTAACAGCAA-3′，下游引物：5′-CTGCCTCTCAATCTTGTTCACC-3′。本发明分子特异性标记引物可对油茶良种长林18号和长林21号进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别油茶良种所不能替代的分子手段。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN104928371
【申请号】CN201510295085
【发明人】李海波, 徐梁, 王丽玲, 魏海龙, 胡传久
【申请人】浙江省林业科学研究院
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月2日