用于mtrr基因位点多态性检测的引物组、其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸的测定与检验方法技术领域，具体涉及用于MTRR基因位点多态 性检测的引物组、其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 中国是世界上出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的 20%。叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因： 一是叶酸摄入量不足，二是由于遗传(基因）缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下（叶酸代 谢通路障碍)。5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR)等基 因变异引起的相应的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和 高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。
[0003] 同型半胱氨酸（Hcy)，是人体内一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物。在 Hcy代谢过程中，叶酸和亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)起关键作用，叶酸和MTHFR共同为 Hcy代谢提供甲基供体。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)作为同型半胱氨酸（Hcy)代谢途 径中的关键酶之一，同样甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR)也是同型半胱氨酸（Hcy)代谢途径 中的一个关键酶，其MTRA2756G位点多态性可能导致血中Hcy水平的改变。甲硫氨酸合成 酶还原酶是保持MTR活性的关键酶，其基因 G66A位点多态性亦可通过影响MTRR的活性而 影响血中Hcy的水平。因此，检测MTRR基因的多态性能够用于临床指导5-FU类、甲氨蝶呤 等个体化用药及育龄期妇女叶酸补充，具有重大意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了用于MTRR基因位点多态性检测的引物组，本发明还提供了 MTRR基 因的位点多态性检测方法，能够用于临床指导5-FU类、甲氨蝶呤等个体化用药及育龄期妇 女叶酸补充，具有重大意义。
[0005] 本发明提供的用于MTRR基因位点多态性检测的引物组由PCR扩增引物和 SNaPshot扩增引物组成，所述PCR扩增引物为： MTRR-A66G-Fwd ：CTGTTACATGCCTTGAAGTGATG(SEQ ID NO. I), MTRR-A66G-Rev ：CGGCTCTAACCTTATCGGATTC(SEQ ID NO. 2)； 所述SNaPshot扩增引物为： SNE-MTRR-A66GR:AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCATGTACCACAGCTTGCTCACA (SEQ ID NO. 3) 〇
[0006] 本发明还提供MTRR基因的位点多态性检测方法，步骤如下： (1) 采用PCR扩增MTRR基因检测位点所在基因片段并纯化； (2) 采用SNaPshot法对扩增产物进行微测序，分析测序结果； 其中，步骤（1)所述扩增时的引物序列为： MTRR-A66G-Fwd ：CTGTTACATGCCTTGAAGTGATG(SEQ ID NO. I), MTRR-A66G-Rev ：CGGCTCTAACCTTATCGGATTC(SEQ ID NO. 2)； 步骤（2)所述SNaPshot法中使用的引物序列为： SNE-MTRR-A66GR:AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCATGTACCACAGCTTGCTCACA (SEQ ID NO. 3) 〇
[0007] 优选地，步骤（1)中所述PCR扩增反应体系为：Q5?热启动超保真2ΧMaster Mix 12.5yL;H20 5.5 yL;引物 5.0yL，模板 DNA2.0yL;反应条件为：98°C 3min;98°C 10s; 58°C 30s;72°C lmin;29 个循环；72°C 5min; 25°C 保温；其中，所述引物为 MTRR-A66G。
[0008] 优选地，步骤（2 )中所述SNaPshot法微测序中，SNaPshot PCR扩增反应体系 为：SNaPshot 预反应混合液 1.25 yL;5 X sequencing buffer 1.50 yL;ddH20 4.25 yL; 2.0以1^似？811〇丨引物；1.(^1^纯化产物；反应条件为：96°0，1〇8 ;55°0,58;60°0,3〇8;25个 循环；4°C保温；其中，所述SNaPshot引物为SNE-MTRR A66G。
[0009] 本发明采用上述引物和扩增条件高效的MTRR-A66G的核苷酸片段。其中，核苷酸 序列中加黑加大的字母为SNP位点。
[0010] 本发明的第三个目的是提供上述引物组在制备检测用于MTRR基因位点多态性试 剂中的引用。
[0011] 本发明的第四个目的是提供上述引物组在检测MTRR基因 A66G的多态性中的应 用。
[0012] 本发明的第五个目的是提供上述引物组在分析甲氨蝶呤的毒副作用，分析5-FU 的疗效，早期发现高Hcy血症，分析叶酸缺乏原因中的应用。
[0013] 本发明的MTRR基因的多态性检测方法具有高灵敏性、高准确度和高精密性的优 点，是一种便捷可靠的MTRR基因位点多态性检测。应用本发明的检测方法能够有效指导临 床5-FU类个性化用药，能够做到早期发现、早期纠正高Hcy血症；同时，为育龄期妇女补充 叶酸提供基因依据。
【附图说明】
[0014] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为本发明SNaPshot法检测MTRR A66G基因多态性的检测结果图。
【具体实施方式】
[0015] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0016] 本申请所用仪器参见表1。
[0017] 表1本申请实验所用仪器 本申请所用试剂如下：
Q5TM热启动超保真2XMasterMix，购自NEB公司，货号：M0494L，-20°C。
[0018] 实施例1 一.采用PCR法扩增检测位点所在基因片段 1待测样本DNA提取 本检测采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取外周血DNA，提取步骤参考试剂盒说明 书。
[0019] 试剂准备 a、 本申请中引物序列为本申请人自行设计，具体序列参见表2，Invitrogen公司生产， 使用浓度为5. Opmol/μ L ;干粉于-20°C保存，有效期一年；工作液于4°C保存，有效期半年； 基因参考序列号为
SNP位点参考NCBI和UCSC数据库。
[0020] 表2 PCR扩增时所用引物序列
b、 取出Q5?热启动超保真2 XMaster Mix，primers，ddH20,室温融化后，短暂离心；配 制引物为MTRR A66G，震荡混匀；短暂离心后备用； 反应体系配制： Q5? 热启动超保真 2 X Master Mix 12. 5 yL H2O 5. 5 μ L 共计 18 μ Ld
[0021] 震荡混匀，短暂离心后，分装18. 0 μ L至标记好的PCR反应管；在PCR反应管中加 入引物5. 0 μ L后转移至标本制备区。本检测使用高保真热启动聚合酶，因此，在工作过程 中可预先配制好18. 0 μ L的反应体系并保存于-20°c，每次使用时取出，加入5. 0 μ L引物即 可用于检测，也可将引物直接与聚合酶混合，保存于-20°C备用。
[0022] 加样扩增 向分装好的PCR反应管中加入2. OyL稀释后的模板；进行PCR扩增，扩增条件如下： 98°C 3min ;98°C IOs ;58°C 30s ;72°C Imin ;29 个循环；72°C 5min ; 25°C