豇豆疫霉菌pcr检测引物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法，专用于豇豆疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间豇豆疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
【背景技术】
[0002]由豆工豆疫霉菌力oraPurss)侵染引起的豆工豆疫病是豆工豆生产上不容忽视的主要病害之一，该病害俗称“死藤”，流行性强，年度间病情差异大，常常造成豇豆植株大面积的枯死，并日趋危害严重，平均发病率为3-11%，严重田块发病率高达65%，甚至告成绝收，极大地影响了豇豆的产量和质量。豇豆疫霉菌主要以厚垣孢子、卵孢子及病残体在土壤中越冬，在适宜的环境条件下，越冬体产生游动孢子，借土壤、灌溉水和风雨等传播到寄主表面，产生芽管侵入，继而在其受害部位再产生孢子囊进行再侵染，尤其在潮湿、多雨条件下，该病害传播与蔓延迅速，常造成豇豆植株大面积死亡。豇豆疫霉菌侵染部位主要为植株根部和近土表茎部，侵染点带有一定的隐蔽性，在发病前期如果未能准确地对病原菌进行检测和鉴定，一旦病害显症发生就很难控制。豇豆疫病还常与豇豆其它病害(如枯萎病、蔓枯病)混合发生，而且发病症状具一定的相似性，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立豇豆疫霉菌快速检测体系，在发病前期对植株及土壤是否携带豇豆疫霉菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行(蔓延)以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。
[0003]豇豆疫霉菌传统的检测鉴定主要依据形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，这种传统检测鉴定方法不仅程序繁琐、所需时间较长、鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，难以满足病害防治中快速、准确和稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期。
[0004]随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原菌快速分子检测方法得到了迅猛的发展和应用，PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速且不需要进行病原菌分离培养的特点，可用于病害显症之前的早期诊断、监测。国内外已有研宄人员利用核糖体转录间隔区(rDNA -1TS)基因为病原菌检测靶标，开发出了灰霉菌、炭疽菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。豇豆疫霉菌属于疫霉属卵菌，大量研宄表明，rDNA -1TS基因序列在疫霉菌不同种间差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将疫霉属中不同种区分开，因此，目前大部分疫霉菌高灵敏性和特异性检测的主要靶标为Yptl(ras-related protein)基因。
[0005]基因包含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些内含子在疫霉菌不同种之间具有多变性，该基因可适合作为疫霉菌分子检测靶标。目前尚无针对该靶基因设计的特异性豇豆疫霉菌检测引物和检测方法的报道，因此，可以通过测定豇豆疫霉菌和其它疫霉菌的基因，对疫霉菌不同种间基因序列进行比对分析，设计出豇豆疫霉菌特异性引物，达到豇豆疫霉菌的快速检测和鉴定。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现在技术中对豇豆疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和鉴定的问题，提供了一种豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测引物和检测方法检测豇豆疫霉菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、快速且结果可靠。
[0007]实现本发明的目的包括下列步骤(技术方案):
1.通过测定豇豆疫霉菌和其它疫霉菌的基因，对疫霉菌不同种间基因序列进行比对分析，设计出对豇豆疫霉菌具有特异性扩增作用的I对引物，即特异PCR检测引物的序列为:
上游引物 PVF:5’_ CTCAGAATGGCCAAGGITTC-3’，
下游引物 PVR:5’- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA-3’；
对豇豆疫霉菌特异性扩增出375bp的产物。
[0008]2.豇豆疫霉菌特异分子检测方法的建立
(I)被豇豆疫霉菌侵染(感染)的植物组织DNA的提取.用于检测植株组织中存在豇豆疫霉菌时，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下:向1.0 mg发病植物组织(洗净的发病豇豆根或茎)中加入0.5 mo I/L NaOH 10 μ?，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12，000 rpm离心6 min，取上清液5 μ?加入0.1mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 495μ?混合均匀，取1.0 μ?作为PCR模板进行扩增。
[0009](2)以步骤(I)提取的DNA为模板，利用PVF/PVR这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系 25 41^，包括2.5 μ? 10XPCR buffer(Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/LdNTP，1.0 U 7?忒NA聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物PVF/PVR各0.4 Mmol/L，25 ng DNA模板，不足部分用无菌超纯水补足；扩增参数为:95 °C预变性5 min, 94 V变性30 s，60 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，共35个循环，最后72 °C延伸10 min。
[0010](3)取步骤(2)的PCR扩增产物5.0 μ?用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，70-100V，40min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约375bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在豇豆疫霉菌，否则所述的检测样品中未存在豇豆疫霉菌。
[0011]本发明的关键性技术是豇豆疫霉菌高效特异性PCR检测引物的设计及其检测方法的建立。为了获得豇豆疫霉菌的特异PCR检测引物序列，以来源于我国不同省份的26株豇豆疫霉菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下:取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中(菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜)，加入900 μ? 2%CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2% CTAB ; 100mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 ；20 mmol/L EDTA，pH8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和 90 μ? SDS (十二烷基苯磺酸钠)【注:CTAB，SDS需60°C预热】，使用振荡器振荡混匀，60°C水浴Ih (DNA释放至缓冲液中)，12000 r.HiirT1离心15 min ;取上清液700 μ?，加等体积酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)，轻轻振荡混勾，12000 r.mirT1离心9 min;取上清液500 KL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000 r.mirf1离心5 min ;取上清液350 ML，加入1/10体积3 mol.L NaAc和2倍体积无水乙醇，-20°C沉淀30 min, 12000 r.mirT1离心5 min ;弃去上清液，加入700μ?冰70%乙醇进行洗涤(稍离心；倾掉上清液)，在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 μ?TE (10 mmol/L Tris-HCl,0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0)溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25 ng/^L待用。根据GenBank中Mora属不同种的基因序列间的差异(在B1Edit中比对)，用Primer Primer5软件设计了豆工豆疫霉菌Phytophthora的特异性引物，引物序列为:上游引物PVF:5’ - CTCAGAAT
GGCCAAGGTTTC _3’，下游引物PVR:5’- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA _3’，引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。在已设计特异引物的基础上，通过PCR反应体系和扩增参数的优化，建立的豇豆疫霉菌检测方法，以供试的豇豆疫霉菌及其它病原菌的基因组DNA为模板，对豇豆疫霉菌特异性引物PVF/PVR的特异性进行验证，结果表明，引物PVF/PVR只能特异性地从供试的26个豇豆疫霉DNA中扩增出大小约为375bp的条带，而其它疫霉菌、病原真菌及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物可以将5工豆疫霉与其它疫霉菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于豇豆疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。
[0012]本发明的显著优点
本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果:
1.特异性强、准确性高:本发明是根据疫霉菌基因含有多个外显子和内含子，且其基因序列保守区和进化区相互间隔的特点，设计了对豇豆疫霉菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的豇豆疫霉菌和携带豇豆疫霉菌的植物组织进行了测试验证，只有豇豆疫霉菌和携带该病菌的样品能特异性地扩增出一条375bp的电泳条带，说有本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。
[0013]2.灵敏度高:传统的病原菌检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明将设计的特异引物与基因通用引物联合起来进行巢式PCR扩增后，对豇豆疫霉菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到lfg，比常规PCR检测高10000倍，说明可以检测出一个游动孢子或一个卵孢子，只要样品中有带菌即可检测出来；
3.实用性强:豇豆疫霉菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。传统的豇豆疫霉的检测方法一般是在植物出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，所需时间较长，而且病原菌在分离时也存在一定的困难，给快速而精确地检测病原物增加了难度，传统的方法由于不能在病害发病前期及时进行田间的病原菌动态的监测和检测，时常给农业生产的防治延误时机。本发明可对植物组织中是否带豇豆疫霉菌进行检测，如果能特异性地扩增出375bp的电泳条带，说明植物组织中存在豇豆疫霉菌，因此本发明可用于豇豆疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，可为确定病害防治最佳时期和制定防治策略的制定提供科学依据，因此本发明具有较好的实用性；
4.操作简便、快速:应用本发明方法，对带豇豆疫霉菌的植物组织进行DNA提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，整个检测过程采用DNA快速提取方法，操作简单，无需对病原菌进行分离培养，大大缩短了检测时间。
【附图说明】
[0014]图1为本发明所要检测的豇豆疫霉菌的特异PCR扩增图，图中:泳道M为2000bpMarker,泳道I为阳性对照，泳道2_3为SE豆疫霉菌，泳道4为大豆疫霉菌，泳道5为辣椒疫霉菌，泳道6为黄瓜疫霉菌；
图2为本发明豇豆疫霉菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR对豇豆疫霉菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对豇豆疫霉菌的灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bp Marker，泳道I为10 ng,泳道2为I ng，泳道3为100 pg，泳道4为10 pg，泳道5为I pg，泳道6为100 fg，泳道7为10 fg，泳道8为I fg，泳道9为100 ag，泳道10为阴性对照；
图3为本发明发病组织的检测结果图，图中泳道M为2000bp Marker，泳道泳道I为阳性对照，泳道2-4为发病的豇豆组织，泳道5-7为健康的豇豆组织，泳道8为阴性对照。
【具体实施方式】
[0015]以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。
[0016]实施例1:PCR检测引物序列的设计及引物对豇豆疫霉菌的特异性扩增 1.引物的设计与合成
根据GenBank中PhyophthoraM不同种的基因序列间的差异(在B1Edit中比对)，用Primer Primer5软件设