一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制剂检测技术领域，具体涉及一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量 检测方法。
【背景技术】
[0002] 茶刺蛾核型多角体病毒（Zragoit/ae /ksciaia nuclear polyhedrosis virus， Zr/aNPV)属杆状病毒科，核型多角体病毒属。Zr/aNPV是茶刺蛾的病原性天敌，通过幼虫取 食后在虫体内迅速增殖，致使其感染发病而死亡。目前这种病毒已可以通过室内大量增殖， 经配制形成产品，进行商业化生产，近年来，ZrZMPV作为一种高效病毒杀虫剂在各省茶区 广泛推广使用，对茶刺蛾进行有效的生物防治，产生了良好的社会、经济和生态效益。因为 这种病毒产品不同于一般的农药，它是一个活体，目前只有通过生物测定的方法进行检测。 即用病毒产品喂饲茶刺蛾幼虫，观察其是否发病来确定，因为病毒是专一的，茶刺蛾病毒只 能感染茶刺蛾幼虫。这种传统的生物测定的方法使得目前在ZrZMPV病毒制剂的生产、使 用过程中存在毒力指标检测粗放、评价周期过长、制剂质量难以有效监控等问题。为了快速 有效检测出生物杀虫剂中Zr/aNPV的含量，建立灵敏、特异而又简易的病毒检测方法至关 重要。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种茶刺蛾核型多角体病 毒的定量检测方法的技术方案。
[0004] 所述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 根据茶刺蛾核型多角体病毒的Ze/ 11基因设计引物Zr/aNPV Ze/ 11 F和引物 Zr/aNPV Ze/ 11 R，所述的引物Zr/aNPV Ze/ 11 F核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，所述 的引物Zr/aNPV Ze/ 11 R核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 2) 从感染茶刺蛾核型多角体病毒的虫尸中提取茶刺蛾核型多角体病毒基因组DNA，获 取目的片段，以目的片段为模板，用步骤1)中设计的一对引物进行PCR扩增得到Ze/ 11基 因片段； 3) 将步骤2)扩增获得的Ze/ 11基因片段与载体pGEM-T连接，转化入大肠杆菌DH5a 中，挑单克隆菌株，摇菌，再采用PCR鉴定单菌落质粒DNA，将鉴定为阳性的重组质粒测序 并测定质粒标准品浓度，保存于-20°C冰箱中，备用，所述的重组质粒核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示； 4) 将质粒标准品按梯度稀释成不同浓度的模板，进行荧光定量PCR，以其模板数的对数 值为X轴，CT值为Y轴做回归曲线，建立检测茶刺蛾核型多角体病毒的标准曲线； 5) 提取待测样品基因组，进行荧光定量PCR反应，根据步骤4)中建立的标准曲线求出 待测样品的拷贝数，确定待测样品的浓度。
[0005] 所述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤2)中 PCR扩增的程序：先94°C预变性3min ;然后94°C变性30s，60°C变性45s ;循环35次，最后 延伸72°C延伸7min。
[0006] 所述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤4) 中荧光定量 PCR 采用 20ul 体系：质粒模板 2PL，SYBR Premix Ex TaqTM (2X) 1〇μL，ROX Reference DyeII 0.4μL，正反引物各0.8μL，加灭菌双蒸水6ul至2〇μL;反应程序为：95°C 30s;95°C 5s，60°C 34s;共40个循环，阴性对照使用灭菌双蒸水。
[0007] 所述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，其特征在于所述的步骤4)中 梯度为 1.0 X 1〇7、1.0 X 1〇6、1.0 X 1〇5、1.0 X 1〇4、1.0 X IO3和 1.0 X 10 2拷贝 /μL。
[0008] 上述的一种茶刺蛾核型多角体病毒的定量检测方法，设计合理，突破了传统的生 物测定技术，解决了茶刺蛾核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本 发明毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规 范茶刺蛾核型多角体病毒的生产应用。
【附图说明】
[0009] 图1为Ze/ 11基因的PCR扩增产物电泳图； 图 1 中：M-DL 2000 Marker ; 2- Ze/ 11 基因 PCR 扩增产物； 图2为重组质粒pGEMTeasy- Ze/ IlPCR扩增产物电泳图； 图 2 中：M-DL 2000 Marker ; 2-重组质粒 pGEMTeasy- Ze/ IlPCR 扩增产物； 图3为Zr/aNPV Ze/ 11基因扩增的熔解曲线图； 图4为Zr/aNPV PCR扩增产物的扩增曲线图； 图5为Zr/aNPV Ze/ 11基因不同稀释梯度的荧光定量PCR标准曲线图。
【具体实施方式】
[0010] 以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0011] 实施例1: ZrZMPV病毒样品的获得及其基因组DNA的提取 以茶刺蛾核型多角体病毒感染茶刺蛾幼虫，收集虫尸，以PBS溶液作缓冲液反复匀浆， 缓冲液体积与虫尸体积比为10:1，1000 Og离心l〇min，重复3次，上清液即为病毒粗提液； 病毒粗提液经35000g离心2小时，沉淀即为经纯化的病毒粒子；用I XPBS反复洗涤纯化的 病毒粒子，至乳白色为止；用 TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0 试剂盒进行茶刺蛾核型多角体病毒基因组的提取。步骤如下：1)病毒的裂解①取200 μ 1的 病毒原液。②加入 200 μ1 的Buffer VGB、20yl 的Proteinase K 和 LOyl^tlCarrier RNA，充分混匀于56°C水浴温浴10分钟。③离心，取上清；向上清中加入200 μ 1无水乙醇， 充分吸打混勾。2)将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中， 12.000 rpm离心2分钟，弃滤液。3)将500 μ1的Buffer RWA加入至Spin Column中， 12.000 rpm离心1分钟，弃滤液。4)将700 μ1的Buffer RWB加入至Spin Column中， 12.000 rpm离心1分钟，弃滤液。注）请确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的100% 乙醇。请沿Spin Column管壁四周加入Buffer RWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上 的盐份。5)重复操作步骤4)。6)将Spin Column安置于Collection Tube上，12, 000 rpm 离心 2 分钟。7)将 Spin Column 安置于新的 1.5ml RNase free collection tube 上， 在Spin Column膜的中央处加入30~50 μ 1的RNase free dH20,室温静置5分钟。8) 12，000 rpm离心2分钟洗脱DNA/RNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到Spin Column膜的中央或再加入30~50 μ 1的RNase free dH20,室温静置5分钟后，12, 000 rpm 离心2分钟洗脱DNA。4°C保存备用。
[0012] 实施例2:目的片段PCR扩增 根据Zr/aNPV基因组序列（FJ362523)的Ze/ 11基因，采用DNAStar软件，设计了一 对特异性引物/r/aNPV Ze/ IlF和引物Zr/aNPV Ze/ 11R，由上海生工生物技术有限公司 合成，引物序列分别为：5' - ACAATGAGAGTGGACCTTACGA-3'（如 SEQ ID NO :1 所示）和 5' - ACGCGCTAAAACACGATATGA -3'（如 SEQ ID NO :2 所示)，扩增 Ze/ 11，PCR 反应采用 25μL 体 系（模板2μL，10Xbuffer2·5μL，dNTP2μL，正反引物各(λ5μL，Tag酶(λ25μL，加灭菌双蒸