检测东方马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一组检测东方马脑脊髓炎病毒的TaqMan MGB荧光定量RT-PCR核苷酸序列以及检测试剂盒，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]东方马脑脊髓炎病毒(Easternequine encephalitis virus, EEEV)属于披膜病毒科甲病毒属，是引起东方马脑脊髓炎的病原体。该病毒主要通过蚊虫传播，而且含有病毒的气溶胶可以通过呼吸道感染人类。东方马脑脊髓炎是传染性和致死率很高的人畜共患病，马属动物死亡率约20%-30%，个别年份和地区高达70%?80%，人感染EEEV的死亡率为30%?40%。因本病最初在美国东方马群中流行，并在马脑中被分离出来，因此得名。
[0003]东方马脑脊髓炎在我国虽有报道，但少有发生，且基本在偏远地区。随着我国马术运动的发展，国际马术比赛的日益频繁，我国进出境马匹的数量也在不断增加。为保障我国养马业的健康发展，保证国际赛事的顺利进行，建立快速、敏感、特异的EEEV荧光RT-PCR检测方法十分必要。本发明针对EEEV NSl基因，筛选高度保守的片段，设计引物探针，建立了 EEEV TaqMan MGB 荧光定量 RT-PCR，。
[0004]中国专利CN 102808043 A公开了一种检测东部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，本发明设计的引物特异性更强，灵敏度更高。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一组新的检测东方马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列以及检测试剂盒:
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
本发明提供的检测东方马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，针对EEEV的NSl基因，筛选高度保守的片段，设计引物探针。
[0006]正向引物的序列如SEQ ID NO:1 所示；P1:5' -CGATGACGCCCAGAAGCT-3'；
反向引物的序列如 SEQ ID NO:2 所示；P2:5' -CTGCCATTGACGACAATTCG-3'；
荧光探针的序列如 SEQ ID NO:3 所示；Probe:5' -FAM-CTGGTTGGGCTCAAC-MGB-3'； 荧光探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。
[0007]本发明还提供一种检测东方马脑脊髓炎病毒的试剂盒，由以下组分组成:
1)裂解液；
2)荧光RT-PCR反应液，其中包括:RT缓冲液、MgCL2、dNTP、正义引物、反义引物和荧光探针；
3)反转录酶M-MLV；
4)RNA酶抑制剂；
5)TaqDNA聚合酶；
6)DEPC 水； 7)阴性对照:东方马脑脊髓炎病毒阴性组织样品；
8)阳性对照:为体外转录的cRNA；
其中，正向引物为序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，反向引物为序列表SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB ；
荧光RT-PCR反应液包括:1XRT缓冲液、1.5mM MgCL2、0.05mM dNTP、0.4μΜ正向引物、0.4μΜ反向引物和0.2μΜ荧光探针。
[0008]本发明的有益效果是:
利用本发明提供的引物和探针及其制备的试剂盒建立的东方马脑脊髓炎荧光定量RT-PCR的检测方法。对建立的方法进行了特异性和敏感性试验。结果表明，建立的TaqManMGB荧光定量RT-PCR最低可检测I拷贝的cRNA ;且与马鼻肺炎病毒(EHV-1 )、马动脉炎病毒(EAV)、马流感病毒(EIV，H3N8)、西尼罗病毒(WNV)、西方马脑脊髓炎病毒(WEEEV)和日本马脑炎病毒(JEV)不发生交叉反应。所制作的标准曲线在10?16拷贝/ yL浓度范围内有极好的线性关系，相关系数为0.998，标准曲线方程式为y=40-3.351ogx ;与常规RT-PCR相比，该方法更加快速，特异性和敏感性更高，灵敏度为常规RT-PCR方法的1000倍。结果表明，本发明的引物、探针和试剂盒可以快速、高效、特异、敏感的用TaqMan MGB荧光定量RT-PCR方法检测东方马脑脊髓炎。
【附图说明】
[0009]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0010]图1 cRNA 的 RT-PCR 鉴定结果；1，DL2000 DNA Marker ;2_4，cRNA RT-PCR 鉴定产物。
[0011]图2 Taqman MGB荧光定量RT-PCR检测EEEV的标准曲线。
[0012]图3 EEEV荧光定量RT-PCR检测方法特异性分析。
[0013]图4 EEEV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性分析。
[0014]图 5 EEEV RT-PCR检测敏感性分析；1.DL2000 Marker ;2_8.1.0XlO6 ?1.0XlO0copies/μ L cRNA RT-PCR 产物，9.空白对照。
[0015]图6中国专利CN 102808043 A方法的敏感性分析。
[0016]图7本发明EEEV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性分析。
【具体实施方式】
[0017]实施例1利用本发明的引物和探针，以及试剂盒，建立Taqman MGB荧光定量RT-PCR检测EEEV的标准曲线
(一)标准阳性模板的制备。
[0018]引物序列为:Tl:5' -GCGACACTGTGCGACCAGAT-3'；
T2:5r -GTATTTGTGTTACGTTGTGT-3'。
[0019]1.1 EEEV基因特异性保守片段的扩增
以 EEEV RNA 为模板，加入 10 μ M Τ1、Τ2 各 I μ L ;5XRT_PCR buffer 5 yL ；2.5mM dNTPI μ L和0.5 μ L Enzyme mix进行RT-PCR扩增。反应条件为50 °C 30 min ；94 °C预变性15 min ；94 °C变性 30 s，56 °C退火 30 s，72 °C延伸 30 s，35 个循环；72 °C延伸 10 min。
[0020]反应完毕，取5 μ L扩增产物，于1%琼脂糖凝胶在I X TAE电泳缓冲液中以100 V电压进行电泳，用凝胶成像系统观察记录结果。
[0021]1.2 标准阳性模板的制备
用Tl和Τ2引物按照1.1的方法进行RT-PCR扩增，将RT-PCR产物按试剂盒说明书(宝生物工程有限公司)进行切胶回收，连接至PMD20-T载体，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，37 °0培养过夜，挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，挑选经PCR鉴定正确的重组质粒，送英骏生物科技有限公司测序。将测序正确的重组质粒命名为PMD20T-EEE。
[0022]选用限制性内切酶油a/将重组质粒pMD20T-EEE进行线性化，并纯化回收，用SP6RiboMa