Mmaf手性异构体的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及-种手性化合物的制备方法，特别涉及细胞有丝分裂抑制剂MMAF手性 异构杂质的关键中间体的制备和应用。
【背景技术】
[0002] 海兔毒素10 (dolastatinlO, D10)是从海洋无壳软体动物截尾海兔（Dolabella auricularia)中分离提取的由4个氨基酸组成的线性缩肽类天然毒性蛋白。MMF是海兔毒 素10(dolastatinl0，D10)的衍生物，可以抑制细胞有丝分裂，具有很强的抗肿瘤活性。其 与肿瘤靶向抗体偶联形成的抗体偶联药物已进入临床研究阶段。
[0003] MMAF 的化学结构由 5 个单体构成：MeVal、Val、Dil、Dap、Phe。
[0004]
[0005] MMAF的全合成工艺是将三肽片段MeVal-Val-Dil与二肽片段Boc-Dap-Phe缩合 而成的。其中关键单体Boc-Dolaproine (Dap)有三个手性中心，在合成过程中会产生4个 手性异构体，但只有2S，2' R，3' S型Dap才能与MeVal、Val、Dil、Phe制备出具有生物活性 的MMAF，其他3种构型的Dap会在MMAF全合成工艺中形成相应的手性杂质，这些杂质的控 制和检验对MMAF的临床应用具有关键的影响。因此对MMAF关键二肽中间体Boc-Dap-Phe 手性异构体的合成进行研究，获得异构体杂质标准品，对实现MMAF药学研究中手性纯度的 控制和检验，具有重要的价值。
[0006]
[0007] 在 Dap 合成过程中 Boc-(2S，2^ R，3^ R)_Dapl 与（2S，2^ S，3^ R)_Dap2 可以 通过正向层析法实现分离，但由于Boc-OSJ' R，3' S)-is〇-Dap3与Boc-OSJ' S， 3' S)-is〇-Dap4在正向层析系统里的极性极为相似，很难通过常规的分离方法获得。因此 这两个对映异构体的制备方法很少有人报道，尽管Ce line Mordant等曾有尝试将这对手 性对映异构体分离，但并未成功（Tetrahedron60 (2004) 97159723)。因此目前还没有一种能 够获得由3或4作为单体的MMAF手性杂质14、15标准品的方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对MMAF手性异构杂质合成中存在的上述问题，提供一种制备 MMAF手性异构杂质的方法。
[0009] 为达到上述目的，本发明的技术方案是一种制备MMAF手性异构杂质的方法，所述 制备方法包括以下步骤：
[0010] 步骤一、Boc-(2S，2' R，3' S)-is〇-Dap，10a 与 Boc-(2S，2' S，3' S)-is〇-Dap， IOb的混合物10与L-苯丙氨酸甲酯11缩合制备获得二肽消旋化合物12 ;
[0011] 步骤二、通过常规硅胶柱正向层析分离方法分别获得高纯度的12a和12b ;
[0012] 步骤三、化合物12a与12b分别与三肽片段MeVal-Val-DiL 13缩合制备获得MMAF 对映异构体杂质14和15 ;
[0013] 其中，MMAF对映异构体杂质14的化学结构式为
[0014]
[0017] 其中，所述步骤一的具体反应条件是：所述混合物10, Boc-Dap-OH溶于二氯甲烷 和二甲基甲酰胺的混合溶液中，加入2-4当量的二异丙基乙胺，1-2当量的2-(7-偶氮苯并 三氮唑）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯，1-2当量的L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐11，得 到所述混合物12。
[0018] 其中，所述步骤二的具体条件为：通过湿法上样，分离展开剂为石油醚：乙酸乙酯 =6 :1，硅胶柱正向层析分离得到所述12a和12b。
[0019] 其中，所述步骤三的具体条件为：将1当量的Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH分别和 1当量的化合物12a或12b溶解于二氯甲烷中，然后加入2. 2当量的N，N-二异丙基乙胺； 加入1. 5当量焦碳酸二乙酯，将反应物浓缩成油状物，用硅胶层析纯化，用正己烷：乙酸乙 酯=5 :1洗脱，分离得到所述MMAF杂质14或15。
[0020] 本发明以易制备的或商业上可得的N-(tert_butoxycarbonyl)-(S)-prolinal， 5 (其制备参考文献 J. Am. Chem. S0C. 1960,82,681，Τ· TetrahedronLett. 1986, 27, 3577)和 丙烯酸甲酯6为原料，经Baylis Hillman反应，获得（2S，3< R和2S，3' S)异构体混合的 甲酯化合物7,采用正向层析方法处理化合物7获得2S，3' S-甲酯化合物8。化合物8在 常温常压下，经钯碳催化还原得到手性构型为2S，3' S，2' R的化合物9a与手性构型为 2S，3' S，2' S的化合物9b的混合物9,其中9a和9b的占比分别为1:1 (其制备参考文献 TetrahedronLett. 2003,937)。混合物 9 进一步与 MeO3BF4 反应上甲基，再于 LiOH-H20/THF 条件下脱甲基，获得Boc-(2S，2' R，3' S)-iso-Dap(IOa)与Boc-(2S，2' S，3' S)-iso- Dap(IOb)的混合物10,文献报道（Tetrahedron60(2004)97159723)和我们的实践均证明 IOa和IOb无法通过硅胶层析实现分离。
[0021] 以上化学反应的方程式如下：
[0022]
[0023] 本发明通过将消旋化合物10与相应的L-苯丙氨酸甲酯11缩合制备获得二肽消 旋化合物12,增强了两种手性异构体12a和12b的极性差异，从而可以通过常规硅胶柱正向 层析分离方法分别获得高纯度12a和12b，12a(98. 83% )和12b (96. 32% )收率达到60%。 化合物12a与12b分别与三肽片段MeVal-Val-Dil (13)缩合制备获得MMAF对映异构体杂 质（14,15)。
[0024] 以上反应的化学反应式如下：
[0027] 化合物12的具体制备条件如下：
[0028] (1) 12 的合成
[0029] Boc-Dap-OH(IO)溶于二氯甲烷（DCM)和二甲基甲酰胺（DMF)的混合溶液中， 加入2.0-4. 0当量二异丙基乙胺（DIEA)，1.0-2. 0当量2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N， Ν'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)，1.0-2.0当量L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐（11， H-Phe-OMeHCl)，通过LC-MS或TLC检测反应，反应得到化合物12。
[0030] (2) 12a和12b的分离条件
[0031] 将化合物12通过湿法上样，分离展开剂为石油醚：乙酸乙酯=6 :1，硅胶柱正向层 析分离得到两种手性的Boc-Dap-Phe-OMe。
[0032] MMAF异构体杂质I (14)和杂质II (15)的具体制备方法如下：
[0033] 将Fmoc-MeVal+Val-Dil-〇H(l当量）和化合物12a或12b(l当量）溶解于二氯甲 烷中，然后加入N，N-二异丙基乙胺（2.2当量）。加入焦碳酸二乙酯（1.5当量），将反应物 置于氮气中。根据LC-MS分析结果，跟踪反应。将混合物浓缩成油状物，用Si02层析纯化， 用正己烷：乙酸乙酯=5 :1洗脱，分离得到MMAF杂质1(14)或杂质11(15)。
[0034] MMAF杂质1(14)或杂质11(15)是以MMAF关键中间体的手性异构体Boc-(2S， 2' R，3' S)-is〇-Dap3与Boc-OSJ' S，3' S)-is〇-Dap4作为单体，因此分离制备出纯度 高、收率高的杂质14和15,对于制备MMF杂质标准品有决定性的作用，从而也为检验MMF 中杂质的浓度，提高MMAF药物纯度提供了关键条件。
[0035] 本方法首次制备出了 MMAF的手性异构杂质的关键中间体，从而为MMAF药物 纯度的检验和提商打下基础。此外，本发明无需使用Ti、Sn、Co、钉、綱等贵金属，或 (S)-SYNPH0S?等昂贵的手性催化剂,也不使用价格昂贵的手性柱,无需无水无氧等严格 的反应条件，工艺流程简单，反应条件温和，轻松实现MMAF手性异构体的分离，产率高，成 本低廉，适于工业化大规模应用，从而能够实现工业化制备MMAF杂质标准品。
【附图说明】
[0036] 图 112a(spl)的 HPLC 图谱。
[0037] 图 212a (spl)的 MS 图谱。
[0038] 图 312b (SP2)的 HPLC 图谱。
[0039] 图 41? (SP2)的 MS 图谱。
[0040] 图512a和12b混合物的HPLC图谱。
[0041] 图6MMAF杂质I (14)与MMAF标准品对照的UHPLC图谱。
[0042] 图 7MMAF 杂质 I (14)的 MS 图谱。
[0043] 图8MMAF杂质II (15)与MMAF标准品对照的UHPLC图谱。
[0044] 图 9MMAF 杂质 II (15)的 MS 图谱。
【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范 围。
[0046] 实施例1，化合物8的制备
[0047] N-Boc-L-脯氨醛（5g)溶于100mL二氯甲烷，加入丙