核酸分析装置以及核酸分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸分析装置以及核酸分析方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，因利用遗传基因技术的发展，遗传基因诊断、遗传基因治疗等利用了遗传 基因的医疗受到关注。另外，在农业和畜牧业领域，也开发出较多将遗传基因用于品种辨 另 1J、品种改进的方法。作为用于利用遗传基因的技术，PCR(Polymerase Chain Reaction: 聚合酶链反应）等技术广泛普及。时至今日，PCR成为在生物体物质的信息解析中必不可 缺的技术。PCR是通过对含有作为扩增的对象的核酸（目标核酸）以及试剂的溶液（反应 液）实施热循环使目标核酸扩增的方法。作为PCR的热循环，一般为以两阶段或者三阶段 的温度实施热循环的方法。
[0003] 另一方面，对于医疗现场中的流感所代表的传染病的诊断，在现状中，使用免疫层 析（immunochromato)等简易检查套件是主流。但是，在这种简易检查中，有可能精度不够， 希望将能够获得更高检查精度的PCR用于传染病的诊断。另外，在医疗机构中的一般门诊 等中，由于诊察的时间受限的关系，能够花费在检查的时间被限制在短时间。因此，例如，对 于流感的检查，现状是牺牲了检查的精度，通过简易的免疫层析等的检查将时间缩短来进 行。
[0004] 根据这种情况，为了实现在医疗现场通过能够获得更高精度的PCR进行的检查， 需要缩短反应所需要的时间。作为用于在短时间进行PCR的反应的装置，例如在专利文献 1中公开了如下生物体样品反应装置，即，通过使填充有反应液以及未与反应液混和并且比 反应液比重小的液体的生物体样品反应用芯片，绕水平方向的旋转轴旋转，使反应液移动 从而实施热循环（专利文献1)。另外，作为PCR的方法，公开了使用磁珠的方法（专利文献 2)、将磁珠作为液滴的移动机构来使用并且使基板上的在温度变化区域的液滴移动从而进 行PCR的热循环的方法（专利文献3)等的。
[0005] 但是，在现有的PCR装置中，无法调查扩增了的DNA的变异，对于定制医疗、细菌的 耐药性的获得，无法容易对应。
[0006] 专利文献1 :日本特开2009 - 136250号公报
[0007] 专利文献2 :日本特开2009 - 207459号公报
[0008] 专利文献3 :日本特开2008 - 012490号公报
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供在使核酸扩增以后能够简便地检测出其变异的核酸扩增 装置。
[0010] 本发明的一个实施方式是如下核酸分析装置，即，该核酸分析装置具备：安装部， 其能够安装核酸扩增反应容器；第一加热器，其对上述核酸扩增反应容器的第一部分进行 加热；第二加热器，其对上述核酸扩增反应容器的第二部分进行加热；旋转机构，其使上述 核酸扩增反应容器与上述加热器一体地旋转；加热器控制部，其控制上述加热器；旋转机 构控制部，其控制上述旋转机构；荧光测定器，其测定荧光；以及核酸融解曲线解析部，其 分析核酸的融解曲线，上述核酸扩增反应容器含有核酸扩增反应溶液以及与核酸扩增反应 溶液相分离的油，上述旋转机构控制部在上述核酸扩增反应容器中上述核酸扩增反应循环 进行的期间，以上述核酸扩增反应容器的上述第一部分处于与上述第二部分相比相对于重 力作用的方向靠下的位置的第一配置、和上述第二部分处于与上述第一部分相比相对于重 力作用的方向靠下的位置的第二配置交替的方式，使上述核酸扩增反应容器旋转，并且在 上述核酸扩增反应循环结束后，控制上述旋转机构使上述核酸扩增反应容器成为上述第二 配置，上述加热器控制部在上述核酸扩增反应循环进行的期间，控制上述第一以及第二加 热器使上述第一部分成为第一温度，使上述第二部分成为第二温度，在上述核酸扩增反应 循环结束后，控制上述第二加热器使上述第二部分的温度随时间经过而升温，荧光测定器 在上述第二部分的温度上升期间，测定从通过上述核酸扩增反应循环扩增了的核酸放出的 荧光，上述核酸融解曲线解析部对从通过上述荧光测定器测定的荧光获得的核酸融解曲线 进行解析。另外，上述核酸扩增反应容器也可以具备管，该管在内部依次具备：第一液柱，其 由第一油构成；第二液柱，其由与油相分离并且清洗结合有核酸的核酸结合性固相载体的 清洗液构成；第三液柱，其由第二油构成；第四液柱，其由若与油混合则相分离并且从结合 有核酸的核酸结合性固相载体将上述核酸溶出的溶出液构成；以及第五液柱，其由第三油 构成，上述核酸扩增反应容器与上述管的第五液柱侧连通。
[0011] 本发明的另一实施方式是核酸分析方法，该核酸分析方法包括：利用核酸扩增反 应容器进行核酸扩增反应的工序，其中，所述核酸扩增反应容器具有第一部分、第二部分以 及连结所述第一部分与所述第二部分的流路，并且所述核酸扩增反应容器含有反应溶液以 及比重与所述反应溶液不同而相分离的油，在该工序中，将核酸扩增反应容器的所述第一 部分加热至第一温度，将所述第二部分加热至第二温度，并且在所述第一部分处于与所述 第二部分相比在重力作用的方向上靠下的位置的第一配置、与所述第二部分处于与所述第 一部分相比在重力作用的方向上靠下的位置的第二配置之间，切换所述核酸扩增反应容 器，使所述反应液在所述第一部分与所述第二部分之间移动；在所述核酸扩增反应结束后， 使所述反应液向所述第二部分移动，使所述第二部分的温度随时间经过而升温，测定从通 过所述核酸扩增反应扩增了的核酸放出的荧光的工序；以及对上述测定的从荧光获得的核 酸融解曲线进行解析的工序。上述核酸扩增反应容器也可以与管的第五液柱侧连通，该管 在内部依次具备：第一液柱，其由第一油构成；第二液柱，其由与油相分离并且清洗结合有 核酸的核酸结合性固相载体的清洗液构成；第三液柱，其由第二油构成；第四液柱，其由若 与油混合则相分离并且从结合有核酸的核酸结合性固相载体将上述核酸溶出的溶出液构 成；以及第五液柱，其由第三油构成，并且通过上述管精制的核酸在上述核酸扩增反应中被 扩增。
【附图说明】
[0012] 图IA以及图IB是盒1的说明图。
[0013] 图2A~图2C是盒1的动作说明图。
[0014] 图3A~图3D是罐3的说明图。
[0015] 图4是固定爪25以及引导板26与安装部62的说明图。
[0016] 图5A以及图5B是PCR容器30的周边的说明图。
[0017] 图6A是PCR装置50的内部结构的立体图。图6B是PCR装置50的主要结构的侧 视图。
[0018] 图7是PCR装置50的框图。
[0019] 图8A是旋转体61的说明图。图8B是在旋转体61的安装部62安装有盒1的状 态的说明图。
[0020] 图9A~图9D是安装盒1时的PCR装置50的状态的说明图。
[0021] 图10是使磁铁71向下方移动时的磁珠7的举动的概念图。
[0022] 图11的图IlA~图IlC是核酸溶出处理的说明图。
[0023] 图12是使磁铁71摆动时的磁珠7的举动的概念图。
[0024] 图13A~图13C是液滴形成处理的说明图。
[0025] 图14A以及图14B是热循环处理的说明图。
[0026] 图15是表示在本发明的一个实施例中将野生型（实验例1)以及变异型（实验例 2 - 3)的流感病毒的基因组扩增之后制成的核酸融解曲线的图。
[0027] 图16是表示在本发明的一个实施例中对在图15中制作的图进行了一阶微分的结 果的图。
【具体实施方式】
[0028] 以下，对本发明的实施方式详细地进行说明。此外，本发明的目的、特征、优点及其 想法通过本说明书的记载，对于本领域技术人员而言清楚易懂，根据本说明书的记载，本领 域技术人员能够容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式是表示本发明的优选实施 方式的例子，是用于例示或者说明而示出的，本发明并不被它们所限定。在本说明书所公开 的本发明的意图以及范围内，基于本说明书的记载，能够进行各种改变以及修饰，这对本领 域技术人员而言是显而易见的。
[0029]===核酸分析装置===
[0030] 首先，在对PCR装置50 (核酸扩增反应装置）说明了以后，对本实施方式的核酸分 析装置的结构?动作进行说明。
[0031] <盒1>
[0032] 图IA以及图IB是盒1的说明图。图2A~图2C是盒1的动作说明图。图2A是 盒1的初始状态的说明图。图2B是从图2A的状态按压柱塞10从而密封件12A与下注射 器22接触时的侧视图。图2C是按压柱塞10以后的盒1的说明图。
[0033] 盒1是进行使核酸从结合有核酸的磁珠7溶出的核酸溶出处理的容器，并且是对 溶出液47进行用于聚合酶反应的热循环处理的容器。
[0034] 核酸提取处理通过罐3进行，并且在通过管20期间被精制。管20的材质并不特 别限定，例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。尤其因为若选择透明的玻璃、树脂作为管20 的材质则能够从管20的外部观察内部，所以更加优选。另外，对于管20的材质，若选择透 过磁力的物质或非磁性体，则在使磁珠通过管20的情况下等，通过从管20的外部给予磁力 容易使磁珠移动，因此优选。另外，由于在附近配置加热器（后述的溶出用加热器65A、高温 侧加热器65B)，所以优选管的材质至少具有100°C以上的耐热性。此外，管20的材质与罐 的材质相同也可。
[0035] 管20具有清洗液液柱45、溶出液液柱47以及油液柱。由于结合有核酸的磁珠7 被外部的磁铁吸引，所以通过沿着管20在外部使磁铁移动，从而磁珠7在管20内移动，通 过清洗液液柱45到达溶出液液柱47。与磁珠7结合的核酸在清洗液液柱45通过清洗液 清洗，在溶出液液柱47溶出。这里，"液柱"是指管20内的规定液体占据一区域时的液体。 例如，将在图2A~图2C中的毛细管23内保持为柱状的液体称为"液柱"。此外，油与其他 溶液相分离（不与其他溶液混和），因此，由油构成的液柱具有防止其两侧的水溶性的液柱 相互混合的功能。虽然优选在液柱之中、液柱之间没有气泡和其他液体，但是只要磁珠7能 够通过液柱，气泡、其他液体也可以存在。
[0036] 虽然油的种类并不特别限定，能够使用矿物油、硅油（2CS硅油等）、植物油等，但 是利用更高粘度的油，在与上侧的液柱的界面使核酸结合性固相载体移动的情况下，能够 提高由油产生的"擦拭效果"。由此，在从上侧的液柱使核酸结合性固相载体移动至由油 构成的液柱的情况下，能够使附着于核酸结合性固相载体的水溶性的成分更加难以带入油 内。
[0037] 热循环处理通过与管20连通的盒1的PCR容器30进行。优选PCR容器30由油 充满，并且管的配置有第五液柱一侧的前端与保持在PCR容器30中的油接触。由于溶出液 47与该油相分离，所以若从管20将溶出液液柱47压出至PCR容器30中，则成为液滴状，另 外，由于与油相比，比重较大，所以成为液滴状的溶出液47沉降。这里，虽然油的粘性并不 特别限定，但是如优选为90cs以下、更加优选为70cs以下、进一步优选为50cs以下、更进 一步优选为30cs以下，如此这样优选小的，由此溶解液能够顺畅地沉降。PCR容器30还具 有固定于与管20连通的一侧的相反侧的端部例如固定于容器内的底的、冻结干燥的核酸 扩增反应试剂。在PCR容器30内沉降的溶出液47与冻结干燥的核酸扩增反应试剂接触，使 核酸扩增反应试剂溶解。另一方面，若通过外部的加热器在PCR容器30形成高温区域36A 和低温区域36B，并且反复使盒1整体与加热器一起上下反转，则液滴状的溶出液47在高温 区域36A与低温区域36B之间交互地移动，从而对作为PCR溶液的溶出液47实施两阶段的 温度处理。
[0038] PCR容器30的材质并不特别限定，例如能够为玻璃、塑料等树脂、金属等。另外，由 于在附近具有高温侧加热器65B，所以优选PCR容器30的材质至少具有100°C以上的耐热 性。若PCR容器30的材质选择透明或者半透明的材质则荧光测定（荧光强度测定）容易， 因此优选。其中，不必在PCR容器30的全部区域为透明或者半透明，只要至少在与荧光测 定器55对置的部位（例如PCR容器30的底35A)为透明或者半透明即可。此外，PCR容器 30的材质与罐3、柱塞10的材质相同也可以。优选与管20连通的一侧的相反侧的端部为 锥状，例如优选为剖面积伴随着接近前端变小的形状。因此，在成为液滴状的溶出液47沉 降时，能够可靠地到达冻结干燥的核酸扩增反应试剂。
[0039] 盒1由罐3与盒主体9构成。对于构成盒1的套件，与罐3以及盒主体9 一起预 先准备有适配器5。通过经由适配器5连接罐3与盒主体9来组装盒1。但是，也能够将罐 3构成为直接安装于盒主体9。
[0040] 在以下的盒1的构成要素的说明中，如图2A所示，将沿着长条的盒1的方向设为 "长边方向"，将罐3侧设为"上游侧"，将PCR容器30侧设为"下游侧"。此外，有时候也将上 游侧简单地表示为"上"，将下游侧表示为"下"。
[0041] ⑴罐
[0042] 图3A~图3D是罐3的说明图。
[0043] 在预先准备为套件的罐3收容有溶解液41与磁珠7。在罐3的开口安装有能够 取下的盖3A(参照图3A)。作为溶解液41，使用5M硫氰酸胍、2% Triton X - 100、50mM Tris - HCl (pH7. 2)。作业者拆下盖3A将罐3的开口打开（参照图3B)，将附着有病毒的 棉签浸于罐3内的溶解液41，使病毒被溶解液41提取（参照图3C)。在搅拌罐3内的液体 时，虽然也可以以图3C的状态振动罐3,但是由于这样溶解液41容易溢出，所以优选如图 3D所示那样，将带有盖5A的适配器5安装于罐3的开口然后振动罐3。由此，搅拌罐3内 的物质，通过溶解液41溶解病毒粒子，核酸游离，同时涂于磁珠7的二氧化硅吸附核酸。磁 珠7相当于核酸结合性固相载体。然后，作业者将安装于罐3的开口的适配器5的盖5A拆 下，经由适配器5将罐3安装于盒主体9 (参照图2A)。
[0044] 罐3由具有挠性的树脂构成，罐3能够膨胀。在柱塞10滑动而从图2A的状态成 为图2B的状态时，通过罐3膨胀，抑制管20内的液体的压力过度上升，从而抑制将管20内 的液体向下游侧压出。优选以罐3容易膨胀的方式在罐3形成变形部3B。
[0045] 此外，对核酸进行提取?扩增的样品并不限定于病毒，也可以是细胞。细胞的由来 也不特别限定，可以是微生物，也可以是高等生物的组织片、血液等均可。
[0046] 此外，溶解液41是指使核酸吸附于作为核酸结合性固相载体的微粒子（例如磁珠 M)的液体。虽然溶解液41只要含有离液物质就不特别限定，但是也可以以使细胞膜破坏或 者细胞中所含有的蛋白质变性为目的含有表面