一株耐重金属的多环芳烃降解菌、组合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物工程领域，尤其涉及一株耐重金属的多环芳烃降解菌、组合物 及其用途。
【背景技术】
[0002] 土壤是污染物的源和汇，随着工业化进程的加速，土壤污染的现象日趋严重。当前 环境中无机污染物及有机污染物复合存在的现象较为普遍。复合污染场地中的无机污染主 要是重金属元素含量超标，而这些重金属主要是汞、镉、铬、铜、锌、铅、镍、砷、硒等。复合污 染场地中有机污染物主要包括有机氯农药（OCPs)、多环芳烃（PAHs)、多氯联苯（PCBs)、邻 苯二甲酸醋（PAEs)等。其中多环芳径（Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是土 壤中一类典型的持久性有机污染物，具有致癌、致畸、致突变的"三致"作用。多环芳烃具有 生物累积性，可以通过食物链和食物网威胁到生态安全和人体健康。早在上世纪八十年代， 美国环保局（USEPA)将16种PAHs列为环境中优先监控的污染物。
[0003] 如上所述，土壤中重金属污染、有机物污染及两者复合污染的现象越来越普遍。当 前已有较多的重金属耐受菌或多环芳烃降解菌从污染场地中被筛选分离出来，但能耐受重 金属同时又具备多环芳烃降解能力的微生物则少有报道。因此，针对重金属及多环芳烃复 合污染场地中多环芳烃的的去除，同时具有良好的重金属耐受性及高效多环芳烃降解能力 微生物的筛选、分离至关重要。
[0004] 当前已分离到较多的多环芳烃降解菌，但针对实际的多环芳烃污染和老化严重的 场地，因多环芳烃生物有效性低而难以被功能微生物利用而去除，使得微生物修复技术在 此类场地中的运用受限制。表面活性剂是一类能显著降低界面张力的物质，对难溶有机化 合物（HOCs)具有增溶的作用，因此可向土壤中添加表面活性剂"活化"老化的多环芳烃。因 此，具有良好的重金属耐受性及高效多环芳烃降解能力微生物在表面活性剂协同作用下去 除污染场地中的多环芳烃是针对解决上述有机无机复合污染土壤中多环芳烃去除的一种 可行的手段。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能耐受重金属的多环芳烃降解菌。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一株耐重金属的多环芳烃降解菌，其特征在于，所述 菌株为浅黄分枝杆菌保藏号为CGMCC No. 10941。
[0007] 进一步，所述降解菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 进一步，所述重金属为(^11、0(1、？13、211、48中的一种或一种以上。
[0009] 进一步，所述多环芳烃为萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘中的一种或一种以上。
[0010] 另一方面，本发明保护所述耐重金属的多环芳烃降解菌用于去除或降解多环芳烃 的用途。
[0011] 进一步，所述用途是指去除或降解土壤、水环境中的多环芳烃的用途。
[0012] 进一步，所述土壤、水为重金属污染的土壤、水。
[0013] 另一方面，本发明保护所述耐重金属的多环芳烃降解菌在多环芳烃污染的土壤、 水环境中生物修复中的应用。
[0014] 进一步，所述土壤、水有多环芳烃或重金属和多环芳烃复合污染。
[0015] 另一方面，本发明还保护一种菌株组合物，其特征在于，由菌株CGMCC No. 10941和 表面活性剂Brij 30组成； 优选的，所述菌株补充保藏信息和表面活性剂Brij 30的用量为，表面活性剂Brij 30 在土壤悬液中含量为10_30g/L，游离菌MI的添加量为以IO9-IO11 CFU/g 土壤的接种量接 种所述菌株。
[0016] 另一方面，本发明保护一种去除污染土壤中多环芳烃去除的方法，其特征在于，采 用表面活性剂Brij 30协同菌株CGMCC No. 10941去除污染土壤中的多环芳烃优选的，所 述菌株CGMCC No. 10941和表面活性剂Brij 30的用量为，表面活性剂Brij 30在土壤悬液 中含量为10_30g/L，游离菌MI的添加量为以IO9-IO11 CFU/g 土壤的接种量接种所述菌株。
[0017] 本发明所述菌株的菌落橘黄色，圆形，表面凸起，干燥，不透明，边缘整齐。菌体呈 短杆状，0.4 μL? X 0.8 - 1.5 μL?，单个或成对排列，革兰氏阳性(见图1和图2)。能够 利用葡萄糖酸钾和甘露醇为碳源，可以自甘油、D-果糖、肌醇、甘露醇产酸，过氧化氢酶、脲 酶实验阳性，β -半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶实验阴性，吐温80水解阳性，七叶苷水解、明 胶水解阴性，硝酸盐还原阳性，45°C不能生长。菌株16srDNA测序序列如SEQ ID NO: 1所示， 测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。经过NCBI BLAST比对，同源性为99%。
[0018] 在初始含量均为50mg/L的萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并芘9中多环芳 烃中，本发明所述菌株不能降解其中的苊、二氢苊、苯并芘，但菌株对萘、芴、菲、蒽、荧蒽、芘 在第四天和第八天均能对进行有效降解。本发明所述菌株具有广泛的底物广谱性。
[0019] 本发明所述菌株对初始浓度50mg/L的芘在第4天降解率可达57. 85%，第9天时可 达 96. 76%。
[0020] 本发明所述菌株对多环芳烃具有较高的耐受浓度。对于初始浓度分别为50、75、 100、200mg/L的芘，接种等量的本发明所述菌株，在相同时间内，随着培养体系中芘含量的 增加，菌株对芘的去除量增加，由此表明在所实验的浓度中，菌株能适应环境中含量高达 200mg/L 的芘。
[0021] 本发明所述菌株在Cu2+浓度为5-100 mg/L培养液中生长良好； 本发明所述菌株在Cd2+浓度为0. 5-50 mg/L培养液中生长良好； 本发明所述菌株在Pb2+浓度为1-500 mg/L培养液中生长良好； 本发明所述菌株在Zn2+浓度为0. 5-100 mg/L培养液中生长良好； 本发明所述菌株在As3+浓度为0. 5-ImM/L培养液中生长良好； 本发明所述菌株在As5+浓度为2. 5-10 mM/L培养液中生长良好。
[0022] 综上，本发明的菌株在 5-100 mg/L Cu2+;0. 5-50 mg/L CM 2+，1-500 mg/L Pb2+， 0. 5-100 mg/L Zn2+，0. 5-lmM/L As3+; 2. 5-10 mM/L As5+浓度中生长良好，即菌株对上述重 金属具有良好的耐受性。
[0023] 所述菌株保藏信息： 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC ; 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所； 保藏日期：2015年6月1日； 保藏编号：CGMCC No. 10941。
[0024] 保藏菌株分类命名为：浅黄分枝杆菌价7_?。
【附图说明】
[0025] 图1是IcoAacteria? gi/ra?生长于LB平板形态图。
[0026] 图2是IcoAacteria?F礙扫描电镜图(放大5000倍)。
[0027] 图3是菌株系统发育树图。
[0028] 图4是gi/ra?菌株降解多环芳径的底物广谱性试验结果图。
[0029] 图5是gi/ra?菌株对花的降解试验结果图。
[0030] 图6是gi/ra?菌株对培养液中不同初始含量的花去除量试验结 果图。
[0031] 图7是IcoAacieria? gi/ra?菌株在不同浓度Cu 2+中的生长曲线图。
[0032] 图8是i(rcoAacieritt? gi/ra?菌株在不同浓度CM2+中的生长曲线图。
[0033] 图9是i(rcoAac ieria? gi/ra?菌株在不同浓度Pb2+中的生长曲线图。
[0034] 图10是i(rcoAac ieria? gi/ra?菌株在不同浓度Zn2+中的生长曲线图。
[0035] 图11是gi/ra?菌株在不同浓度As 3+中的生长曲线图。
[0036] 图12是gi/ra?菌株在不同浓度As 5+中的生长曲线图。
[0037] 图13是添加表面活性剂后gi/ra?菌株对16 EPA-PAHs的去除效 率图。
[0038] 图14是添加表面活性剂后i(rco6ac ?eriw?价7 菌株对花的去除效率图。
[0039] 图15是添加表面活性剂后gi/ra?菌株对焚蒽的去除效率图。
[0040] 图16是添加表面活性剂后i(rco6ac ieriw?价7 菌株对菲的去除效率图。
【具体实施方式】
[0041] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例 中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0042] 以下实施例所用培养基配方为： 所述gi/ra?的LB培养基成份为：胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L， 氯化钠 l〇g/L。
[0043] 所述LB培养基固体平板成份为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠 IOg/ L，15g/L纯化琼脂粉。
[0044] 所述 MSM 培养液的成分为！K2HPO4 6. 0g/L，KH2PO4 5. 5g/L，Na2SO4 2. Og/ L，KCL 2g/L，MgSO4. 7H20 0. 2g/L，Iml微量金属盐溶液/L。所述微量金属盐溶液 配方为：N(CH2COOH) 31.5g/L, MnSO4. H2O 0.5g/L, NaCl l.Og/L, FeSO4. 7H20 0.1g/L， CoSO4. 7H20 0. 18g/L, CaCl2. 2 H2O 0. lg/L, ZnSO4. 7H20 0. 18g/L, CuSO4. 5H20 0.0 lg/L, KAl(SO4)2. 12H20 0. 02g/L, H3BO3 0.0 lg/L, Na2MoO4. 2 H2O 0.0 lg/L, NiCl2. 6H20 0. 025g/ 1^似256〇3.5!120 0.38/1。？!1值为7.8。
[0045] 所述MSM培养基固体平板的成份为：上述MSM培养液成份，15g/L纯化琼脂粉。
[0046] 以下实施例所用本发明菌株(浅黄分枝杆菌giJVw?)简称Ml菌。
[0047] 实施例1:菌株的筛选与分离 富集培养：以北京焦化厂多环芳烃污染土壤为菌源，称取IOg 土壤，加入90ml无菌水和 0. 5 g玻璃珠，在180r/min，30°C摇床中震荡3h，静置30min后，取上清液5ml接种到含芘 50mg/L己灭菌的45ml MSM培养液中，30°C，180 r/min摇床培养。每隔10天转接5ml培 养液于45ml芘浓度梯度成100、200、300、500mg/L递增的新鲜灭菌MSM培养液，经过5次 转接完成多环芳烃降解菌的富集。
[0048] 菌株筛选：取一定量最后一次富集培养液涂布于MSM固体平板后，平板倒扣于装 有芘的烧杯中，采用升华法在MSM固体平板铺上一层芘膜。涂有芘膜的平板置于30°C恒湿 培养箱中培养，培养期间多次观察，出现透明圈的菌落即为芘降解菌。
[0049] 菌株分离纯化：挑选出现透明圈的菌落，经过多次平板划线分离得到降解菌的纯 菌株，菌株名记为MI。MI用LB培养基30°C培养7天，菌落橘黄色，圆形，表面凸起，干燥，不 透明，边缘整齐。菌体呈短杆状，0.4 μπι X 0.8 - 1.5 μπι，单个或成对排列，革兰氏阳 性(见图1和图2)。能够利用葡萄糖酸钾和甘露醇为碳源，可以自甘油、D-果糖、肌醇、甘露 醇产酸，过氧化氢酶、脲酶实验阳性，β -半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶实验阴性，吐温80水 解阳性，七叶苷水解、