一株耐铜的醋酸钙不动杆菌kw3及其在铜矿废水处理中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株耐铜的醋酸钙不动杆菌KW3及其在 铜矿废水处理中的应用。
【背景技术】
[0002] 铜矿废水主要来自于铜采矿和选矿工艺，具有排放量大、排放持续性强、污染物种 类多、危害大、不易控制等特点，是一种非常难处理的废水。根据《铜、镍、钴工业污染物排 放标准》（GB 25467-2010)中规定，自2011年起，现有企业水污染物中总铜排放量需低于 1.0 mg/L，新建企业水污染物中总铜排放量需低于0. 5mg/L。但是，目前铜矿废水中所含重金 属离子大大超过工业废水排放标准，在外排过程中，如果不加以处理，随意排放，将会严重 污染地表水和地下水，对周边生态环境产生毁灭性的后果。
[0003] 铜矿废水中含有大量重金属离子，且含金属离子的铜矿废水呈硫酸型，一般pH值 多在2. 5~6. 0之间，对污水处理系统污泥里的微生物具有强烈的抑制作用，使得微生物无 法正常生长。目前还未有可以耐高浓度铜离子的醋酸钙不动杆菌及其在铜矿废水处理中的 应用的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一株耐铜的醋酸钙不动杆菌KW3及其在铜矿废水处理中 的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
[0006] 一株耐铜的醋酸钙不动杆菌，其特征在于，该菌株命名为醋酸钙不动杆菌KW3,已 于2015年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），保藏单位地 址：中国武汉武汉大学，其保藏号为CCTCC NO :M 2015376。
[0007] 上述醋酸钙不动杆菌KW3的菌落形态为：菌落呈浅黄色，菌落直径0. 5~1mm，形 状不规则，边缘光滑整齐，有光泽，易挑取；菌体为球杆状，革兰氏阴性菌，严格需氧；最适 基本培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，最佳pH是6. 5,最适生长温度为32~37°C，最佳渗透 压（NaCl% )浓度为1. 3%。
[0008] 上述醋酸钙不动杆菌KW3的16S rDNA基因序列特征为：16S rDNA基因序列长度 为1425bp，采用BLAST分析法将16S rDNA序列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌 株与醋酸钙不动杆菌的亲缘关系最接近，同源性高达99%以上。
[0009] -株醋酸钙不动杆菌KW3在铜矿废水处理中的应用。
[0010] 上述方案中，所述应用的方法为：将醋酸钙不动杆菌KW3菌液与铜矿废水按照体 积比为1:20~1:10的比例混合，调节混合液的pH为5~8,将混合液置于25~37°C条件 下恒温培养72h。
[0011] 上述方案中，所述醋酸钙不动杆菌KW3菌液通过如下方法获得：将醋酸钙不动 杆菌KW3接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于32~37°C、120~140r/min条件下培养 24h ~48h 至菌体浓度达到 2. OX IO9~L OX 10 lclcfu/mL。
[0012] 上述方案中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水定容至1000mL，调pH 7. 0。
[0013] 本发明的有益效果如下：本发明所述醋酸钙不动杆菌KW3在高浓度酸性铜矿废水 中具有较好的适应能力和去除废水中铜离子的能力，该菌株在72h之内对铜矿废水中的铜 离子的去除效率达到67. 4%~80. 3%;本发明为处理高浓度酸性铜矿废水提供了有用的菌 源，拓宽了对醋酸钙不动杆菌的应用，具有较强的应用价值。
【附图说明】
[0014] 图1为醋酸钙不动杆菌KW3的PCR产物琼脂糖电泳图，其中左为扩增产物，右为 Marker，Marker 条带从上至下分别为：2000,1000, 750, 500, 250,100bp。
[0015] 图2为基于16S rDNA序列的醋酸钙不动杆菌KW3的系统发育树。
【具体实施方式】
[0016] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0017] 实施例1 :菌株的分离、筛选和鉴定
[0018] ( -）材料准备：
[0019] 1.实验废水和污泥取自湖北省大冶铜绿山铜铁矿洗矿池。
[0020] 2.培养基
[0021] 分离培养基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，硫酸铜0. lg，琼脂15g，蒸馏 水定容至 lOOOmL，pH 7. 0。
[0022] 筛选培养基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，琼脂15g，硫酸铜0. 1~ 1.0 g (以0.1 g为单位递增），蒸馏水定容至1000mL，pH 6. 5。
[0023] 驯化培养基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，硫酸铜0. 5g，蒸馏水定容至 1000 mL? pH 6. 5〇
[0024] 牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂15g，蒸馏 水定容至 lOOOmL，pH 7. 0。
[0025] 牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏5. 0g，蛋白胨10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸馏水定容至 1000mL? pH 7. 0〇
[0026] 3.实验仪器和设备：
[0027] 高压蒸汽灭菌锅（LS-B75L-I)，超净工作台（SW-CJ-2F)，恒温振荡培养箱 (BS-IE)，生化培养箱（LRH-70F)，pH计（PHS-3C)，PCR仪（A300)，电泳仪及电泳槽 (Bio-Rad)，凝胶成像系统（GIAS-4400)，光学显微镜（BK3000)，原子吸收分光光度计 (AA-240FS)〇
[0028] (二）菌株的分离筛选与驯化：
[0029] 1.称取Ig取自湖北省大冶铜绿山铜铁矿洗矿池底泥样品，加入到装有IOOmL无菌 水的250mL锥形瓶中，置恒温摇床110r/min，30°C振荡15分钟，得泥水混合液A ;
[0030] 2.取IOmL泥水混合液A，转入含有IOOmL分离培养基的500mL锥形瓶中，恒温摇 床110r/min，30°C振荡培养24h，得菌悬液B ;
[0031] 3.取ImL菌悬液B涂布接种于分离培养基上，37°C恒温培养3天，挑取在菌落特征 上有明显差异的单菌落，反复划线接种于分离培养基上，重复操作5次，直至得到纯化的菌 株；
[0032] 4.将纯化的菌株反复划线接种于筛选培养基上，筛选培养基中硫酸铜浓度由低到 高递增，37°C恒温培养，得到在筛选培养基上生长状况最好，耐受硫酸铜浓度最高的一株菌 株，将其命名为醋酸钙不动杆菌菌株KW3 ;
[0033] 5.挑取筛选出的醋酸钙不动杆菌菌株KW3单菌落，反复接种于驯化培养基，37°C 恒温培养，直至醋酸钙不动杆菌菌株KW3在驯化培养基内能稳定快速生长。
[0034] (三）菌株特性及鉴定
[0035] 醋酸钙不动杆菌菌株KW3的菌落形态为：菌落呈浅黄色，菌落直径0. 5~1mm，形 状不规则，边缘光滑整齐，有光泽，易挑取；菌体为球杆状，革兰氏阴性菌，严格需氧；最适 基本培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，最佳pH是6. 5,最适生长温度为32~37°C，最佳渗透 压（NaCl% )浓度为1. 3%。
[0036] 醋酸钙不动杆菌菌株KW3的16S rDNA基因序列长度为1430bp，其PCR产物琼脂糖 电泳图见图1，采用BLAST分析法将醋酸钙不动杆菌KW3的16S rDNA序列与GenBank数据 库进行比对分析，发现醋酸钙不动杆菌KW3与醋酸钙不动杆菌的亲缘关系最接近，同源性 高达99%以上。采用MEGA程序对该菌进行了系统发育进化分析，并绘制系统发育树，如图 2所示。
[0037] 该菌株已于2015年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中 心），保藏单位地址：中国武汉武汉大学，分类命名为：Acinetobacter calcoaceticus KW3， 保藏号为CCTCC NO :M 2015376。本发明筛选出了一株具有较强的铜吸附能力的醋酸钙不 动杆菌，目前尚无醋酸钙不动杆菌用于铜矿废水处理的报道，这拓宽了人们对醋酸钙不动 杆菌的应用研宄，为处理高浓度酸性铜矿废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的应用 价值。
[0038] 实施例2 :醋酸钙不动杆菌KW3在铜矿废水处理中的应用
[0039] 醋酸钙不动杆菌KW3在铜矿废水处理中的应用，具体的应用方法包括如下步骤： (1)醋酸钙不动杆菌KW3菌液的获得：将醋酸钙不动杆菌KW3接种至牛肉膏蛋白胨液体培 养基中，于32~37°〇、120~1601'/111丨11条件下培养2411~4811至菌体浓度为2.0\109~ 1.0\10 1(1(^11/1^;所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：牛肉膏5.(^，蛋白胨10.(^，似(：1 5. 0g，蒸馏水定容至1000ml，调pH 7. 0 ; (2)将醋酸钙不动杆菌KW3菌液与铜矿废水按照体 积比为1:20~1:10的比例混合，调节混合液的pH为5~8,将混合液置于25~37°C条件 下恒温培养72h。
[0040] 具体地，取ImL菌体浓度为2. OX IO9CfVmL的醋酸钙不动杆菌KW3菌液接种于 IOmL铜矿废水中（初始铜浓度约为162.2mg/L，pH 3.18)，调节？!1为5，置于37°0、15〇1·/ min振荡培养72h，计算菌株对废水中铜的去除率。结果表明：该菌株能在72h内去除铜矿 废水中的铜130. 25mg/L，去除率达到80. 3%。
[0041] 具体地，取ImL菌体浓度为1.0 X 101(lCfu/mL的醋酸钙不动杆菌KW3菌液接种于 20mL铜矿废水中（初始铜浓度约为162.2mg/L，pH 3.18)，调节pH为8,置于25°C、150r/ min振荡培养72h，计算菌株对废水中铜的去除率。结果表明：该菌株能在72h内去除铜矿 废水中的铜109. 32mg/L，去除率达到67. 4%。
[0042] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变 动仍处于本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1. 一株耐铜的醋酸钙不动杆菌，其特征在于，该菌株命名为醋酸钙不动杆菌KW3,保藏 于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M 2015376。2. 权利要求1所述耐铜的醋酸钙不动杆菌在铜矿废水处理中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：将醋酸钙不动杆 菌KW3菌液与铜矿废水按照体积比为1:20~1:10的比例混合，调节混合液的pH为5~8， 将混合液置于25~37°C条件下恒温培养72h。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述醋酸钙不动杆菌KW3菌液通过如 下方法获得：将醋酸钙不动杆菌KW3接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于32~37°C、 120~140r/min 条件下培养 24h~48h 至菌体浓度为 2. OX 109~1. OX 101(lcfu/mL。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水定容至 1000 mL，调 pH 7.0。
【专利摘要】本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株耐铜的醋酸钙不动杆菌KW3及其在铜矿废水处理中的应用。本发明提供的醋酸钙不动杆菌KW3已于2015年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2015376。本发明所述醋酸钙不动杆菌KW3在高浓度酸性铜矿废水中具有较好的适应能力和去除废水中铜离子的能力，该菌株在72h之内对铜矿废水中的铜离子的去除效率达到67.4％～80.3％；本发明为处理高浓度酸性铜矿废水提供了有用的菌源，拓宽了对醋酸钙不动杆菌的应用，具有较强的应用价值。CCTCC NO：M 201537620150616
【IPC分类】C02F3/34, C12N1/20, C12R1/01, C02F103/10
【公开号】CN104946570
【申请号】CN201510399023
【发明人】康薇, 郑进
【申请人】湖北理工学院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月8日