一种热凝性多糖、其发酵菌株及应用
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明公开了一株土壤杆菌及其应用于发酵制备新型热凝性多糖（PGHX)的方法 并且公开了该发酵产物的结构特征及其热凝性能。具体涉及该土壤杆菌筛选方法，该菌株 经鉴定命名为土壤杆菌Ugro如cteri腫取HX1126)保藏编号为CGMCC 10943,以及利用 该微生物生产PGHX的方法。
[0003]
【背景技术】
[0004] 每年，全球石化工业生产的塑料高达数千万吨，而其中部分用于生产附加值低且 易损耗的各种包装盒、袋及农用地膜等，这些产品使用后散布于地表或漂浮于水面，难以 循环再利用。更甚者，由于其生物不可降解性，造成了日益严重的生态环境污染。环境 污染的压力已使许多国家考虑采用生物可降解塑料替代部分化工合成塑料，并陆续颁布 了一些法规禁用某些塑料制品，同时鼓励科研人员加大对生物可降解塑料的研宄力度。 在此类研宄中，由于具有生物可相容性和生物可降解性，采用发酵法生产聚羟基烷酸（ Polyhydroxyalkanoate简称PHAs)以及聚β-羟基丁酸（PHB)成为研宄的热点。但与化 工合成的塑料相比，生产成本较高，所以许多研宄人员一直致力于提高发酵法生产强度和 采用新的提取技术的研宄，以期降低生产成本，提高市场竞争。
[0005] 生产生物柴油过程中，甘油是其所产生副产物之一，由于生物柴油的迅猛发展产 生了大量的副产物，大量的副产物的积累给环境造成极大的污染，对副产物的开发利用势 在必行。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明发明人对生物可降解材料的研宄比较感兴趣，在筛选产P HB菌株的过 程中，筛选到一株发酵液具有热凝性质的菌株，该菌株经鉴定为土壤杆菌，并命名为 5/7. ΗΧ1126。在对该菌株发酵产热凝性产物的发酵条件，产物提取等方面 进行研宄的过程中发现，该菌株可利用甘油为唯一碳源，发酵产热凝性产物。经鉴定该产物 为5/7. HX1126产胞外多糖，单糖组成成分为半乳糖。值得一提的是，该产物 具有良好的吸水性能，可吸收超过30倍自身质量的水分，同时，该产物具有良好的热凝性 能，30 g/L浓度下，KKTC加热10分钟，可形成热凝胶，凝胶强度245~1450 g/cm2,并且， 随着研宄的不断深入，凝胶强度有望得到继续提高。发酵过程中利用甘油作为低成本生产 原料生产具有热凝性质且可生物降解的新型热凝性多糖（PGHX)，不仅具有良好的经济前景 而且对环境保护可以起到促进作用。
[0008] 另外，提取工艺与采用发酵法生产聚羟基烧酸（Polyhydroxyalkanoate简称 PHAs)以及聚β-羟基丁酸（PHB)的提取工艺相比，简单易行。PHAs或者PHB作为胞内多 糖，提取时通常需要对细胞进行破壁处理，提取成本相对比较高。而本发明说述具有热凝性 的新型多糖（PGHX)，该种多糖作为水不溶性胞外多糖，在本发明中，只需经过酒精，水的漂 洗就可获得，所用酒精可通过旋转蒸发回收再利用。所得产品色泽纯白，凝胶后胶体为半透 明状，具有很好的弹性。
[0009] 本发明的一个目的，一株土壤杆菌腫5/7. ) HX1126,已于2015年06 月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院，中科院微生物研宄所，邮编：1〇〇1〇1，保藏编号为CGMCC No. 10943。 [0010] 本发明的另一个目的，提供了利用上述菌株进行发酵及提取吸水多糖的方法，包 括如下步骤： 第1步、斜面培养：将菌株划线接种于斜面培养基中进行培养； 第2步、种子培养：将第1步中斜面种子接种至种子培养基进行培养； 第3步、发酵培养：按5~15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基进行培养，得 到发酵液产物； 第4步、提取产物：提取采用如下两种方法之一，第一种：将发酵液产物过滤除杂，除 上清，再依次加入乙醇和水进行清洗、除上清，离心分离后得到产物，冷冻干燥后即得；第二 种：将发酵液产物过滤除杂，静置除上清，再加入NaOH溶液，离心后，收集上清液，再于上 清液中加入HCl溶液，调节pH至中性，离心后取沉淀，用水洗涤，冷冻干燥后即得。
[0011] 所述的第1步中，斜面培养基中包含如下质量百分比的组分：20~50 g/L甘油或 者D-甘露醇，1-10 g/L酵母粉，1~10 g/L蛋白胨，1~10g/L牛肉膏，15~20 g/L琼 脂，pH 6. 5~7. 5 ;发酵温度28~32°C，培养时间40~60小时。
[0012] 所述的第2步中，种子培养基中包含如下质量百分比的组分：20~50 g/L甘油 或者D-甘露醇，1~10 g/L酵母粉，1~10 g/L蛋白胨，1~10 g/L牛肉膏，1~5 g/L (NH4)2HPO4,0.5 ~5 g/L KH2PO4, 5 ~20 ml/L 玉米浆，pH 6. 5 ~7. 5;发酵温度 28 ~32°C， 培养时间20~30小时。
[0013] 所述的第3步中，发酵培养基中包含如下质量百分比的组分：5~60 g/L甘油或 者D-甘露醇，1~10 g/L酵母粉，1~10 g/L (NH4)2HPO4, 5~20 ml/L玉米浆，0.5~3g/L MgSO4 ·7Η20,0· 2~I g/L FeSO4 ·7Η20,0· 02 ~I g/L MnSO4 ·Η20, Ig~20g/L NaHPO4 ·12Η20， Ig~20g/L NaH2PO4 · 2H20, pH 5· 3~8· 3 ;发酵温度28~32°C，好氧培养48~90小时。
[0014] 培养基的灭菌温度为115~12rC，20min。碳源单独灭菌后分装，磷酸盐膜滤除 菌。
[0015] 所述的第4步中，第一种的提取方法参数是：乙醇的加入体积是发酵液体积的 0. 5~2倍，乙醇清洗次数为2次以上；水的加入体积是发酵液体积的5~10倍，水清洗次 数为3次以上；第二种的提取方法参数是：NaOH溶液的体积是发酵液的1~3倍，浓度是 0. 5N，HCl溶液浓度是1N。
[0016] 本发明的另一个目的，提供了利用上述菌株在发酵及提取PGHX中的应用。
[0017] 本发明的另一个目的，一种具有吸水性，热凝性的多糖； 化学名称：β-1，3-聚半乳糖 分子式：（C6HltlO5) η η 聚合度，η>50。
[0018] 结构式：
其中： (I) η>50,当聚合度低于50时，该种多糖将较难形成热凝胶。聚合度与凝胶强度有关， 聚合度越大，凝胶强度就越大。另外，发酵周期短，产物聚合度低；发酵周期长，产物聚合度 高。可根据实际需求，生产不同聚合度，即不同凝胶强度的该种热凝性多糖。
[0019] (2)本发明所涉及的多糖PGHX是以半乳糖为糖单元，以β 1-3糖苷键连接的直 链线性结构。
[0020] (3)该产物具有良好的吸水性能，能吸收自身质量30倍甚至更多水分； (4)具有良好的热凝性能，上述的多糖配置成30 g/L的水溶液，100°C加热10分钟，形 成热凝胶，凝胶强度245~1450 g/cm2。
[0021] 本发明筛选得到的产热凝性多糖的菌株，经16S rRNA基因测序和按《伯杰氏细菌 鉴定手册》进行生理生化鉴定，认为该菌株属土壤杆菌属5/7.)。该菌的细 胞呈短杆状，革兰氏阴性，好氧。在斜面培养基上培养48小时，菌落呈圆形，淡黄色，表面光 滑，边缘整齐。
[0022] 生物样品材料保藏：本发明筛选得到的土壤杆菌（Jgro知c ieriw? 5/7.)菌株 HX1126已保存在中国北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保 藏编号为CGMCC No. 10943,保藏日期2015年06月02日。
[0023] 有益效果 1本发明的特点是从大量微生物中筛选得到产一种新的多糖的土壤杆菌HX1126,其在 合适条件下，能产这种多糖，产率可以达到24. 9 g/L以上。
[0024] 2对该种多糖的结构进行分析(单糖组成，红外光谱，核磁)，该种多糖的单糖组成 为半乳糖，是一种新型多糖；同时，该种多糖具备热凝性，生物可降解性，高吸水性，这些性 能使该种多糖具有在生物可降解材料，医药，化妆，食品等领域具有广泛的应用前景； 3本发明提取工艺简单，产品色泽纯白，所得产品胶体呈半透明状，且该产品的凝胶强 度可以达到245~1450 g/cm2。
[0025]
【附图说明】
[0026] 图Ia是产品外观； 图Ib是凝胶外观； 图Ic是凝胶被拉伸之后显示其弹性的表观效果图； 图2a是单糖组成分析，标准品的保留时间图，图谱中的图例1是氨基葡萄糖，2是鼠李 糖，3是阿拉伯糖，4是氨基半乳糖，5是半乳糖，6是葡萄糖，7是木糖，8是甘露醇，9是果糖， 10是核糖； 图2b是提取得到的产物的单糖组成分析，样品的保留时间图； 图3是产品红外光谱； 图4是产品氢谱； 图5是产品碳谱； 图6是异核二维谱。
[0027]
【具体实施方式】
[0028] 以下是土壤杆菌（yferoAacieritt? ) CGMCC 10943筛选、鉴定及发酵生产聚半乳 糖研宄的实施例。但本发明并不限于所列出的几个实例。
[0029] 实施例1菌株筛选 从京杭运河无锡段，江南大学处取土样6份。将样品于筛选培养基中，30°C，180rpm培 养20小时后，稀释，涂布于筛选平板，30°C，培养72小时后挑选出单菌落划线分离培养。将 菌株接种于装有30ml筛选培养基的三角瓶中，30°C，180rpm培养80小时。其中一瓶发酵液 在煮沸处理的过程中，表现出热凝性质，挑选出该株菌株，进一步对其发酵条件，发酵产物 进行研宄。
[0030] 筛选培养基：50 g/L葡萄糖，1.5 g/L酵母粉，0.3 g/L蛋白胨，0.2 g/L牛肉膏， 1-2 g/L (NH4)2SO4, lg/L KH2P04, 2g/L CaC03,0. 5g/L MgSO4 · 7H20, pH 6. 5-7. 5。
[0031] 实施例2发酵培养产PGHX (I)斜面培养：将菌株划线接种于斜面培养基（20g/L甘油，5 g/L酵母粉，2 g/L蛋白 胨，2g/L 牛肉膏，20 g/L 琼脂，pH 6.5-7.5)，28-32°C，培养 40-60 小时，备用。
[0032] (2)种子培养：将步骤（1)中斜面种子接种至种子培养基（20g/L甘油，1-5 g/L 酵母粉，2 g/L 蛋白胨，2 g/L 牛肉膏，1-2 g/L(NH4)2HP04，l g/L KH2P04，10-20 ml/L 玉米 浆，pH 6. 5-7. 5)，250ml 三角瓶装液 40-100ml，于 28-32°C培养 20-30 小时。
[0033] (3)发酵培养：按5-15%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基（50 g/L甘 油，1-2 g/L 酵母粉，1-2 g/L (NH4)2HPO4, 2 ml/