一种产低温碱性蛋白酶的菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种产低温碱性蛋白酶的菌株。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶是非常重要的一种水解酶，国内外相关数据显示，在所有的工业酶制剂中， 蛋白酶占据了 75%，是工业用酶比例最大的，销售额约占世界年销售总额的百分之60%左 右。而碱性蛋白酶是世界工业酶制剂中最重要的酶制剂之一，其用途非常广泛，受到了大家 的广泛关注。目前，碱性蛋白酶主要应用在洗涤和皮革行业中，其中在洗涤剂中，99%以上 的都或多或少地加入各种蛋白酶，导致了如今供不应求的需求关系。目前作为洗涤剂添加 剂的碱性蛋白酶多为中温蛋白酶，最适反应温度通常在50-70°C，但在发展中国家，洗涤剂 通常在室温25°C左右使用，因此添加到洗涤剂中的碱性蛋白酶的催化效率不高，许多研宄 者开始着手低温碱性蛋白酶的研宄。但目前还没有实际应用的产低温碱性蛋白的菌株。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种产低温碱性蛋白酶的菌株，从而弥补现有技术不足。
[0004] 本发明的产低温碱性蛋白酶的菌株，为芽孢杆菌（Bacillus sp. )WFWBac-l，于 2015年4月9日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研宄所 的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 10703。
[0005] 本发明筛选的菌株用于发酵生产碱性蛋白酶；
[0006] 本发明还提供一种代谢生产碱性蛋白酶的方法，是以蔗糖为碳源，蛋白胨为氮源， 初始pH为9. 0的培养基中接种筛选的菌株，培养温度25°C，振荡培养48h ;
[0007] 其中菌株的接种量优选为10%。
[0008] 本发明菌株生产的碱性蛋白酶，最适作用温度为20°C，最适作用pH为9. 0，Μη2+对 该酶有较强的激活作用，Zn2+，EDTA和PMSF对该酶具有一定的抑制作用。
[0009] 本发明筛选的菌株性状优良、产蛋白酶活力高；该菌株在以蔗糖为碳源，蛋白胨为 氮源，培养基初始pH 9. 0,培养温度25°C，接种量为10%的条件下150rpm振荡培养48h时， 所产蛋白酶活性最高能达到995U/mL。
【附图说明】
[0010] 图1 :碳源对菌株的发酵酶活的影响图，
[0011] 图2:氮源对菌株的发酵酶活的影响图，
[0012] 图3 :发酵时间对WFWBac-I菌株产酶的影响图，
[0013] 图4 :发酵温度对WFWBac-I菌株产酶的影响图，
[0014] 图5 :培养基起始pH值对WFWBac-I菌株产酶影响图，
[0015] 图6 :接种量对WFWBac-I菌株产酶的影响图，
[0016] 图7 :温度对酶活的影响图。
【具体实施方式】
[0017] 本发明所使用的培养基的信息如下：
[0018] LB营养琼脂培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂粉20g、海水lOOOmL，在 121°C下高压灭菌15min。
[0019] 酪蛋白培养基：酪蛋白 10g、蛋白胨 5g、酵母 2. 5g、KH2PO4O. 3g、MgSO4 · 7H200. 5g、 NaCl lg、琼脂粉20g、海水1000mL，在121°C下高压灭菌15min。
[0020] LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨5g，陈海水lOOOmL。
[0021] 蛋白酶活力测定方法采用Folin-酷法测定蛋白酶的活力。酶活定义：lmL酶液在 一定PH值和温度下，每分钟水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸的酶量为1个酶活力单位（U/mL)。 计算公式如下：
[0022] 蛋白酶活力（U/mL) = (AXNX4)/10
[0023] 式中：A--由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；
[0024] 4--4毫升反应液取出ImL测定（即4倍）；
[0025] N--酶液稀释的倍数；
[0026] 10--反应 10min。
[0027] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0028] 实施例1 :菌株的筛选及鉴定
[0029] 从青岛海域收集的裙带菜中进行内生细菌的分离，并将得到的单菌落点种于酪蛋 白培养基上，观察各菌株产透明圈情况，进行菌种的初筛；然后将产透明圈的菌株接种于液 体发酵培养基上，于25°C摇瓶培养3d，在4°C，10000r/min条件下离心15min，取上清液，测 定其蛋白酶活力，筛选出产蛋白酶活力最高的菌株。
[0030] 参照《伯杰细菌鉴定手册》和《系统鉴定》，依据其生理生化特征对WFWBac-I菌株 进行分类鉴定。
[0031] 对WFWBac-I菌株进行生理生化鉴定试验，结果如表1所示，参照《伯杰细菌鉴定手 册》和《细菌系统鉴定手册》，鉴定结果显示：WFWBac-I菌株能水解酪蛋白，明胶，淀粉，使硝 酸盐还原，鉴定该菌为革兰氏阳性菌。
[0032] 表1生理生化鉴定结果
[0034] 注：" + "表示反应为阳性：表示反应为阴性。
[0035] 并进行16S rDNA序列分析，具体步骤如下：
[0036] (1)基因组的DNA提取
[0037] 制备基因组DNA时，首先根据细菌是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，对革兰氏 阴性菌，先用Digestion Buffer，后用Proteinase K裂解细菌，对于革兰氏阳性菌，先用溶 菌酶驱除细胞壁，后用Proteinase K和去污剂裂解细菌，释放出基因组DNA。
[0038] (2) PCR 反应
[0039] ① PCR 体系建立（50 μ L):
[0040]
[0041] ②PCR程序设定
[0042] 预变性 94°C 4min ;循环 94°C 45s，55°C 45s，72 °C lmin，30 个循环；修复延伸 72 °C 8min ；
[0043] ③引物序列：
[0044] 7F 5, CAGAGTTTGATCCTGGCT 3, 18bp
[0045] 1540R 5, AGGAGGTGATCCAGCCGCA 3, 19bp
[0046] (3) DNA琼脂糖切胶纯化
[0047] 用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，并用电泳检测纯化后DNA的纯度和含量。
[0048] (4)目的片断的TA克隆和筛选
[0049] 以pEASY-Tl为载体进行TA连接，目的片段与载体的比例为8:1。于42°C下转化到 E. coli 110菌株。最后涂布于含有氨苄青霉素的LB平板中。通过蓝白斑筛选和菌落PCR 鉴定阳性克隆。
[0050] (5)质粒DNA提取
[0051] 参照TransGen公司的质粒提取试剂盒进行质粒提取。
[0052] (6) DNA 测序
[0053] 由上海生工生物工程技术服务有限公司将提取的质粒DNA，进行测序。
[0054] (7)系统进化树的构建及分析
[0055] 从NCBI的基因库中寻找与WFWBac-I的16S rDNA相关的序列，将相关性最高的菌 株同WFWBac-I菌株一同构建系统进化树，并进行同源性比较，进而确定菌株的分类。鉴定 WFWBac-I为芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，命名为Bacillus sp. WFWBac-I。
[0056] 实施例2菌株的发酵条件优化
[0057] 1、碳源对WFWBac-I细菌产酶的影响
[0058] 在液体培养基中分别用待测碳源（葡萄糖，蔗糖，淀粉，果糖，乳糖）为唯一碳源， 25°C、150r/min培养48h后测定蛋白酶活。结果如图1所示，蔗糖作为碳源时，WFWBac-I菌 株的酶活最高，葡萄糖、乳糖、淀粉较低，果糖最低。可见，该菌株能充分利用蔗糖中的碳源 进行生长代谢繁殖，所以，蔗糖为WFWBac-I的最佳碳源。
[0059] 2、氮源对WFWBac-I细菌产酶的影