一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷d2的大肠杆菌表达菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种高产酪醇和/或红景天苷和淫 羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株，以及所述大肠杆表达菌中生物合成酪醇和/或红景天苷 和淫羊藿次苷D2中的应用。
【背景技术】
[0002] 红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物， 至今已有1000多年的应用历史，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山 症等作用。除此之外，红景天还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红 景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。近年来，以红景天苷作为主要原料生 产的药剂、饮料、食品以及化妆品等产品种类越来越多，其苷元酪醇是一种具有重要工业价 值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体。人们对红景天苷及其苷 元酪醇的关注程度不断提高。除红景天苷和酪醇外，红景天植物中还含有其它一些化学物 质,例如,淫羊藿次苷D2。
[0003] 红景天苷（Salidroside)具有以下特征：化学名称为2-(4_hydroxyphenyl) ethyl- β -D-glucopyranoside，分子式为 C14H2tlO7,分子量为 300. 304, CAS 号为 10338-51-9，
结构式为 淫羊藿次苷D2 (Icariside D2)具有以下特征：化学名称为p-( 〇 2-hydroxyethyl)-phenol_D-pyranoglucoside，分子式为 C14H2tlO7,分子量为 300. 31，CAS 号 为38954-02-8,结构式为
其苷元酪醇（Tyrosol)具有以下特征：化学名称 为 4-(2-Hydroxyethyl)phenol，分子式为 C8HltlO2，分子量为 138. 164, CAS 号为 501-94-0,结 构式为
[0004] 目前，红景天苷的生产主要是对红景天植株进行化学提取。野生红景天生长条件 恶劣，植被资源稀有，而且红景天苷的量很低，如现在最常用的高山红景天和大花红景天， 其植株中红景天苷的量只有0. 5%-0. 8%。人工栽培的红景天成本高而有效成分量低，达不到 市场要求的标准。因而化学提取正面临严峻的现实。除化学提取外，化学合成、微生物转化 及组织培养生产红景天苷也是研究热点。
[0005] 明海泉以酪醇和溴代四乙酰葡萄糖为原料，以Ag2CO3为催化剂，成功合成了红景 天式（明海泉，红景天式合成及药理作用，药学通讯，1986, 21 (6) : 373)。
[0006] 本发明的发明人提交的名为"一种在大肠杆菌中生物合成酪醇的方法及应用"（申 请号201310133238. 7)的专利申请中，在大肠杆菌（Escherichia coli)中构建了一条新的 不同于植物的酪醇生物合成通路，该途径利用大肠杆菌本身合成的4-羟苯基丙酮酸，引入 酵母菌的4-羟苯基丙酮酸脱羧酶（AR010)将其转化为4-羟苯基乙醛（4HPAA)，4HPAA脱氢 生成酪醇。
[0007] 王梦亮等以D-葡萄糖和酪醇为底物，探索出了一种借助于微生物合成红景天甙 的方法(王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D-葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天甙的初 步研究，催化学报，2006, 27 (3) : 233-236)。
[0008] 在采用组织培养方式进行红景天苷的生物合成方面，研究成果最为成熟的是Wu 等用致密愈伤组织体系进行的红景天苷高产出率培养条件的研究。从高山红景天的根、 茎、叶、子叶等分离体得到的相应的几种愈伤组织，并对其生长速度、红景天苷量和培养繁 殖条件进行筛选，确定了生成高产出率红景天苷的最佳条件，红景天苷最高收获率可达 到干重 57. 72mg/g，为野生植株的 5 ~10 倍（Wu S，Zu Y, Wu M High yield production of salidroside in the suspension culture of Rhodiola sachalinensis [J]J Biotechnol, 2003, 106(1) :331)。
[0009] 张罗红等采用硅胶柱色谱与制备型高效液相色谱，首次从红景天苷原料药中分离 出了淫羊藿次苷D2,是酪醇酚羟基糖基化的产物(张罗红，彭艳，都述虎，红景天苷原料药中 有关物质的分离与结构鉴定，中药与临床，2010, 1 (3) : 21-23)。
[0010] 但是化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；微生物转化效 率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低。至今还没有红景天苷微 生物从头合成的相关报道。淫羊藿次苷D2在红景天中含量较红景天苷更低，至今也没有任 何生物合成的报道。因此，实现红景天苷及淫羊藿次苷D2的微生物体内生物全合成途径具 有重要的科研价值及社会效益。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是为了克服上述缺陷，提供一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿 次苷D2的大肠杆菌及其应用。
[0012] 本发明的发明人在研究中发现，可以通过调控大肠杆菌酪氨酸代谢通路实现酪醇 的高产：通过对aroG和tyrA基因进行点突变以分别获得如SEQ ID No :1所示的tyrA*基 因，如SEQ ID No :2所示的aroG*基因；在敲除feaB基因基础上，进一步敲除tyrR，pykA, pykF，pheA 基因；通过导入含有 tyrA*，aroG*，ppsA，tktA，aroB，aroD 和 aroE 基因的载体， 使这些基因进行过表达；调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，来增强酪醇的合成，构建高产红 景天苷苷元酪醇的大肠杆菌表达菌株；然后通过在大肠杆菌表达菌株中表达UDP葡萄糖基 转移酶UGT73B6,异源合成红景天苷及淫羊藿次苷D2,从而实现红景天苷及淫羊藿次苷D2 在大肠杆菌中的生物全合成。
[0013] 基于此，一方面，本发明提供了一种大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌表达 菌株不表达feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因，含有并能够表达如SEQ ID No :1所示的 tyrA* 基因，如 SEQ ID No :2 所不的 aroG* 基因，以及 ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE 和 AR010 基因。
[0014] 优选地，所述大肠杆菌表达菌株还含有并能够表达UGT73B6基因，保藏编号为 CGMCC No. 8897,。
[0015] 另一方面，本发明还提供了如上所述的大肠杆菌表达菌株在生物合成酪醇和/或 红景天苷和淫羊藿次苷D2,和/或在制备含有酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的产品 中的应用。
[0016] 再一方面，本发明还提供了一种在大肠杆菌中生物合成酪醇和/或红景天苷和淫 羊藿次苷D2的方法，其中，该方法包括：将如上所述的大肠杆菌表达菌株进行发酵培养，使 其生物合成酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2。
[0017] 大肠杆菌作为最简单的模式生物，其背景清晰，生长快速，易于规模化发酵培养， 成本低廉；而且本发明通过构建新的酪醇合成通路，调控从葡萄糖到酪氨酸的代谢流，得到 高产红景天苷苷元酪醇的大肠杆菌，酪醇产量达到600mg/L ;进一步引入UDP葡萄糖基转移 酶，将红景天苷与酪醇的生物合成途径有机地结合在一起，能够显著提高红景天苷的产量， 可达50mg/L，同时，该菌株还可以合成淫羊藿次苷D2,产量达40mg/L。本发明提供了一种高 效高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的新的生产途径，也为酪醇和/或红景天苷和 淫羊藿次苷D2的大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。
[0018] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0019] 生物保藏
[0020] 本发明的大肠杆菌表达菌株Λ A(AROK)和UGT73B6)，分类命名为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)，于2014年03月05日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编 码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 8897。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的在大肠杆菌表达菌株中生物合成酪醇、红景天苷及淫羊藿次苷D2 的途径示意图；
[0022] 图2为菌株Λ A (AR010)和Λ A (AR010和UGT73B6)的发酵产物以及酪醇和红景 天苷标准品的HPLC结果，其中，1是酪醇和红景天苷的标准品混合样，2是Λ A (AR010)的 发酵产物，3是Λ A (AR010和UGT73B6)的发酵产物，峰I为酪醇峰，峰II为红景天苷峰，峰 III为淫羊藿次苷D2峰。
[0023] 图3为菌株Λ A (AR010和UGT73B6)发酵产物的HPLC红景天苷峰（峰II)及淫羊 藿次苷D2峰(峰IID的MS图谱。
[0024] 图4为菌株Λ A (AR010和UGT73B6)发酵产物的红景天苷峰（峰II)(图4-1)及 淫羊藿次苷D2峰(峰IID (图4-2)的NMR-H图谱。
【具体实施方式】
[0025] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0026] -方面，本发明提供了一种大肠杆菌表达菌株，其中，所述大肠杆菌表达菌株不表 达feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA基因，含有并能够表达如SEQIDNo :l所示的tyrA*基因， 如 SEQ ID No :2 所不的 aroG* 基因，以及 ppsA，tktA，aroB，aroD，aroE 和 AR010 基因。
[0027] 根据本发明，当本发明的大肠杆菌菌株还含有并能够表达UGT73B6基因的情况 下，能够有效地进行红景天苷及淫羊藿次苷D2的表达，因此，优选地，本发明的大肠杆菌表 达菌株还含有并能够表达UGT73B6基因，保藏编号为CGMCC No. 8897。
[0028] 本发明中，基因 feaB，tyrR，pykA，pykF，pheA，以及 aroG，tyrA，ppsA，tktA， aroB，aroD，aroE为酪氨酸代谢途径的相关基因，分别为苯乙醒脱氢酶基因 feaB (Ge nBank:U00096. 3(1，447, 519. · 1，449, 018))、酪氨酸调节蛋白基因 tyrR (GenBank:UO 0096. 3(1，386, 720. · 1，388, 261))、丙酮酸激酶基因 A pykA (GenBank:U00096. 3(1，3 86, 720. · 1，388, 261))、丙酮酸激酶基因 F pykF (GenBank:U00096. 3(1，755, 698. · 1 ，757, 110))、分支酸变位酶及预苯酸脱水酶基因 pheA (GenBank:U00096. 3(2, 737, 7 45. . 2, 738, 905))、分支酸变位酶T及预苯酸脱氢酶双功能酶基因 tyrA (GenBank : U00096.3(2, 738, 948.·2, 740, 069))、3-deoxy-D-arabin〇-he