1] 本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌菌株ΥΡ01，在好氧条件下，利用无机盐培养 基发酵48小时，可将95g/L葡萄糖转化生成69g/L丙酮酸。
[0032] 本发明以野生型大肠杆菌为出发菌株，通过改造脂肪酸合成-降解途径，积累乙 酰辅酶A，间接抑制丙酮酸的消耗，同时强化糖酵解途径，弱化TCA循环，实现对整体代谢网 络的调控，达到积累丙酮酸的目的。本发明中构建的大肠杆菌基因工程菌可在无机盐合成 培养基中正常生长，无需添加维生素和乙酸盐等。
【附图说明】
[0033] 图1为大肠杆菌合成丙酮酸代谢途径改造示意图；
[0034] 图2为大肠杆菌基因工程菌构建方法中基因敲除操作步骤示意图；
[0035] 图3为大肠杆菌基因工程菌YPOl不同发酵时间的0D600值、丙酮酸浓度和葡萄糖 浓度。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所有的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中得到。
[0038] 实施例1、如图1所示，大肠杆菌基因工程菌I的构建
[0039] 大肠杆菌基因工程菌I的构建需要两个步骤。
[0040] (1)敲除大肠杆菌K-12MG1655的酯酰辅酶A硫酯酶III基因（fadM)
[0041] 如图2所示，基因敲除采用两步同源重组的方法。
[0042] 第一步，采用热激转化法将pKD46质粒转入出发菌株大肠杆菌K-12MG1655中，得 到重组大肠杆菌A。具体操作为：吸取I yL pKD46质粒加入感受态细胞中混合均匀，静止 5min后置于42°C水浴锅热激90s，冰水浴3min。随后加入800 μ L无抗生素的LB培养基， 在30°C，HOrpm孵育lh，涂布于Amp抗性平板，30°C静止培养16h至单菌落长出。
[0043] 第二步，NCBI数据库中查到fadM基因的NDA序列，以此为依据设计引物fadM-F/ fadM-R，其中 fadM-F 中包括 fadM 上游 50bp、fadM 下游 50bp 及 cat-sacB 的上游 25bp， fadM-R包括fadM下游50bp及cat-sacB的下游25bp，以质粒p EASY-cat-sacB为模版进 行PCR扩增。引物序列为：
[0044] fadM-F (SEQ ID NO ：5)：
[0045] CGTAATCTGGCGGTATTAACCCTGTAATTAATTTGCATAGTGGCAATTTTACGTTTTGTGGTGCCGGAT GCTCAAGCCGCATCCGGCGACACCCGGAATAGTGACGGAAGATCACTTCGCAG
[0046] fadM-R (SEQ ID NO ：6)：
[0047] TATTCCGGGTGTCGCCGGATGCGGCTTGAGCATCCGGCACCACAAAACGTATCAAAGGGAAAACTGTCC ATATGC
[0048] 扩增体系为：
[0049]
[0050] PCR 程序为：98 °C 预变性 2min，（98 °C 热变性 10s，55 °C 退火 20s，72 °C 延伸 2min)35cycles，72°C 5min。得到含有 fadM-F/fadM-R 和 cat-sacB 序列的 DNA 片段，记作 DNA片段I，序列表中SEQ ID NO :1。
[0051] 第三步，DNA片段I用于第一轮重组。将DNA片段I电转至重组大肠杆菌A。电转 条件为：首先准备重组大肠杆菌A的电转化感受态细胞；将50 μ 1感受态细胞置于冰上，加 入50ng DNA片段I，冰上放置2分钟，转移至0. 2em的Bio-Rad电击杯，电击参数为2. 5kv。 电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm，30 °C孵育 2小时。取200 μ 1菌液涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，过夜培养后，挑选5个 单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为重组大肠杆菌B。
[0052] 第四步，重组大肠杆菌B的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为： 将重组大肠杆菌B活化于LB液体培养基，过夜培养；取ImL培养物接种于IOmL含有蔗糖 的LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株 挑取400个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检 测失去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌α (重组大肠杆 菌α )。
[0053] (2)敲除大肠杆菌基因工程菌α的酯酰辅酶A硫酯酶II基因（tesB)
[0054] 如图2所示，基因敲除采用两步同源重组的方法。
[0055] 第一步，NCBI数据库中查到tesB基因的NDA序列，以此为依据设计引物tesB-F/ tesB-R，其中 tesB-F 中包括 tesB 上游 50bp、tesB 下游 50bp 及 cat-sacB 的上游 25bp， tesB-R包括tesB下游50bp及cat-sacB的下游25bp，以质粒p EASY-cat-sacB为模版进 行PCR扩增。引物序列为：
[0056] tesB-F (SEQ ID NO ：7)：
[0057] ATCACGCATTTCTGCCTGTAATTAGCCCGTAATTCAGACCATTGCACCCAAAAAATAGCCGGAGGTGAA AACCGTCCGGCTGTTTTTTGCAGTGCTTGTTGTGACGGAAGATCACTTCGCAG
[0058] tesB-R (SEQ ID NO ：8)：
[0059] AACAAGCACTGCAAAAAACAGCCGGACGGTTTTCACCTCCGGCTATTTTTATCAAAGGGAAAACTGTCC ATATGC
[0060] 扩增体系和PCR程序同实例I (1)，得到含有tesB-F/tesB-R和cat-sacB序列的 DNA片段，记作DNA片段II，序列表中SEQ ID NO :2。
[0061] 第二步，DNA片段II用于第一轮重组。将DNA片段II电转至重组大肠杆菌α。电 转条件为：首先准备重组大肠杆菌α的电转化感受态细胞；将50 μ 1感受态细胞置于冰 上，加入50ng DNA片段II，冰上放置2分钟，转移至0. 2em的Bio-Rad电击杯，电击参数为 2. 5kv。电击后迅速将Iml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，200rpm， 30°C孵育2小时。取200 μ 1菌液涂在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，过夜培养后， 挑选5个单菌落进行PCR验证。挑选一个正确的单菌落，将其命名为重组大肠杆菌C。
[0062] 第三步，重组大肠杆菌C的自身同源重组，删除cat-sacB基因片段。具体操作为： 将重组大肠杆菌C活化于LB液体培养基，过夜培养；取ImL培养物接种于IOmL含有蔗糖的 LB液体培养基，过夜培养；取一环菌液划线培养于LB固体培养基，过夜培养；每个菌株挑取 400个单克隆点对点划线于含有氯霉素和不含氯霉素的固体培养基，过夜培养；PCR检测失 去氯霉素抗性的菌落，测定序列验证正确的即为大肠杆菌基因工程菌I。
[0063] 实施例2、如图1所示，大肠杆菌基因工程菌II的构建
[0064] 敲除大肠杆菌基因工程菌I的乙酰磷酸化酶基因（pta)和乙酸激酶基因（ackA)， 构建大肠杆菌基因工程菌II。
[0065] 如图2所示，基因敲除采用两步同源重组的方法。
[0066] 第一步，NCBI数据库中查到ackA和pta基因的NDA序列，以此为依据设计引 物 ackA-pta-F/ackA-pta-R，其中 ackA-pta-F 中包括 ackA 上游 50bp 及 cat-sacB 的上游 25bp，ackA-pta-R 包括 ackA 上游 50bp、pta 下游 50bp 及 cat-sacB 的下游 25bp，以质粒 p EASY-cat-sacB为模版进行PCR扩增。引物序列为：
[0067] ackA-pta-F (SEQ ID NO ：9)：
[0068] CTATGGCTCCCTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCGTGACGGAAGATCACTTCG CAGA
[0069] ackA-pta-R(SEQ ID NO： 10)：
[0070] TTATTTCCGGTTCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAGGAAGTACCTATAATTGAT ACGTGGCTA