一种耐阿霉素u87细胞模型及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞模型的建立，具体地说，涉及一种耐阿霉素 U87细胞模型及其应 用。
【背景技术】
[0002] 脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤。 年发病率约为3-8人/10万人口。如同其他肿瘤（疾病）一样，胶质瘤也是由于先天的遗 传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致的。一些已知的遗传疾病，例如神经纤维瘤 病（I型）以及结核性硬化疾病等，为脑胶质瘤的遗传易感因素。
[0003] 化疗药物阿霉素（DOX)通过细胞内途径促进肿瘤细胞凋亡，常用于脑胶质瘤的治 疗，但易发生耐药，而耐药后再化疗效果很差。普通脑胶质瘤细胞株在研宄脑胶质瘤耐药机 制中存在局限性，而脑胶质瘤耐药细胞株更能从分子生物学角度来研宄其耐药机制，有助 于进一步寻找脑胶质瘤耐药后的治疗方法。同时，脑胶质瘤等肿瘤也可导致癫痫发作，导致 难治性癫痫，脑胶质瘤耐药细胞株也可用于难治性癫痫耐药的研宄。
[0004] 中国期刊《中华神经外科杂志》2009年4月第25卷第4期，刊出的论文"人神经 胶质瘤耐阿霉素细胞株的建立及其耐药机制的初步研宄"，选用常用的化疗药物阿霉素和 人恶性胶质母细胞瘤细胞株SHG44为研宄对象，用ADM浓度梯度递增结合间歇诱导法建立 多药耐药的神经胶质瘤细胞株SHG44/ADM，并对SHG44/ADM的耐药特性及机制进行了初步 研宄，其建立的人神经胶质瘤耐药细胞株SHG44/ADM通过药敏实验表明对ADM的IC50为 17. 83±0. 52,耐药指数为10. 7,冻存3个月、复苏后对ADM耐药指数为10. 5,对耐药的稳定 性无明显影响。
[0005] 中国期刊《中国临床神经外科杂志》2014年02期，刊出的论文"胶质瘤多药耐药 细胞株U251/TMZ的生物学特性"，探讨了胶质瘤U25/替莫唑胺（TMZ)多药耐药细胞株的生 物学特性，采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质瘤多药耐药细胞株U251/TMZ，光镜 观察细胞形态，细胞计数计算倍增时间，四甲基偶氮唑蓝法检测耐药指数，流式细胞仪检测 细胞周期，逆转录-PCR法检测多药耐药性I(MDRl)、Bcl-2、多药耐药相关蛋白5 (MRP5)、肺 耐药相关蛋白I(LRPl)等mRNA表达，结果胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ对TMZ、依托泊苷、 硫酸长春新碱、环磷酰胺、阿霉素的耐药指数分别为4. 39、3. 61、2. 64、2. 00、1. 63。
[0006] U87细胞是人脑胶质瘤细胞系，被用于人脑胶质瘤病理机制的研宄，以及人脑胶质 瘤药物的筛选等。目前还未见耐阿霉素 U87细胞模型的相关报道。而建立更多的耐药细胞 模型对于探讨人脑胶质瘤耐药产生原因及其机制，进一步指导对人脑胶质瘤的治疗具有重 要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种耐阿霉素 U87细胞模型。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供所述的耐阿霉素 U87细胞模型的用途。
[0009] 本发明的第三个目的是，提供所述的耐阿霉素 U87细胞模型的建立方法。
[0010] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0011] -种耐阿霉素 U87细胞模型，所述的耐阿霉素 U87细胞模型的保藏号为CCTCC C201531。
[0012] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] 所述的耐阿霉素 U87细胞模型的用途，用于研宄脑胶质瘤耐药机制、寻找脑胶质 瘤耐药逆转的靶点、筛选治疗脑胶质瘤或解除脑胶质瘤耐药的药物。
[0014] 所述的耐阿霉素 U87细胞模型的用途，用于脑胶质瘤引起的难治性癫痫的机制研 宄、寻找脑胶质瘤引起的癫痫的耐药逆转靶点、筛选治疗脑胶质瘤引起的癫痫或解除脑胶 质瘤引起的癫痫耐药的药物。
[0015] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0016] 所述的耐阿霉素 U87细胞模型的建立方法，它包括以下步骤：
[0017] a)培养U87细胞；
[0018] b)U87细胞用阿霉素开始干预，然后换无阿霉素培养基，至细胞生长恢复正常即细 胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30%的情况下3至5天可长至90%后再 开始正常传代并提高阿霉素的浓度，每次阿霉素的干预时间均为24小时；
[0019] c)对干预后的U87细胞进行检测，获得耐阿霉素 U87细胞模型。
[0020] 本发明优点在于：
[0021] 本发明通过科学的方法建立了耐阿霉素 U87细胞模型，建立细胞模型的过程不 是机械式设置药物浓度梯度和定期传代，最后筛选出存活的细胞系，而是密切观测细胞生 长状态，待达到细胞形态饱满，无漂浮死细胞，细胞密度为30 %的情况下3至5天可长至 90%后再开始正常传代并提高阿霉素的浓度，通过该方法建立了一株耐阿霉素 U87细胞模 型，其耐药系数均显著高于现有的脑胶质瘤细胞模型，且耐药稳定性好，且耐药性和耐药稳 定性均优于相同方法得到的其他耐阿霉素 U87细胞株。本发明建立的细胞模型可用于脑胶 质瘤耐药机制、脑胶质瘤耐药逆转、预防脑胶质瘤化疗耐药和提高脑胶质瘤化疗敏感性方 面的研宄，还可用于脑胶质瘤引起的难治性癫痫的机制研宄、寻找癫痫耐药逆转的靶点、筛 选治疗癫痫或解除癫痫耐药的药物。
【具体实施方式】
[0022] 下面对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0023] 实施例1
[0024] 一、实验材料
[0025] U87细胞购自中科院。
[0026] 阿霉素（DOX)购自凯基生物（中国，南京）。
[0027] 阿霉素工作液用细胞培养基（SH30243. 01B+10% FBS，购自美国HyClone公司）配 制。
[0028] 二、实验方法
[0029] 1)U87 细胞用 SH30243. 01B+10% FBS+100U/ml 青霉素 +0· lmg/ml 链霉素培养。 [0030] 2)用DOX起始浓度为lng/ml开始干预，给予DOX 24小时后换无药培养基 (SH30243. 01B+10% FBS+lOOU/ml 青霉素 +0· lmg/ml 链霉素）。
[0031] 3)待细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30%的情况下3至5天 可长至90 %后再开始正常传代（P)并提高DOX的浓度。
[0032] 母细胞U87在第5代起（P5)到PlO加 lng/ml DOX干预，共3次，每次24小时；在 P6,加 5ng/ml DOX 干预 2 次；在 P7-P9,加 10ng/ml DOX 干预，共 3 次；在 P10-P11，加 30ng/ ml DOX 干预，共 2 次；在 P12-P14,加 50ng/ml DOX 干预，共 6 次；在 P15-P17,加 100ng/ml DOX干预，共7次；在P18-P22,加150ng/ml DOX干预，共8次。细胞生长良好，-80°C储存。
[0033] 细胞每次干预24小时后更换无 DOX培养基，至细胞生长恢复正常（即细胞稳定生 长、形态饱满、无漂浮死细胞）后再进入下一轮DOX干预。历时5个月，最终在U87细胞株 中DOX至150ng/ml，标记为人星形胶质瘤细胞株U87R-D0X。耐药株建立过程中U87共传 19代。该耐药株已于2015年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉大学， 430072)，保藏编号为CCTCC C201531，培养物名称为人星形胶质瘤细胞株U87R-D0X。
[0034] 4)计算半抑制浓度（IC50)和耐药系数（RI)。
[0035] 采用WST-I法（美国Roche公司）检测细胞存活率。每孔5000个U87及人星形 胶质瘤细胞株U87R-D0X细胞分别接种至96孔培养板，24小时后给予不同浓度的DOX (0， 0· 1，1，10,100, 500,1000ng/ml)干预，48小时后每孔加10 μ L WST-I试剂，在培养箱中37°C 继续培养2小时，然后用酶标仪检测450nm波长的吸光度。通过Graphpad Prism软件计算 IC50。耐药系数（RI)=耐药株IC50/敏感株IC50。耐药细胞建成后放-80°C冰柜冻存，1 个月、6个月后复苏，再次检测耐药系数以确定其耐药系数的稳定性。
[0036] 三、实验结果
[0037] 阿霉素对各U87细胞株的IC50见表1，人星形胶质瘤细胞株U87R-D0X的耐药系数 见表2。
[0038] 表1阿霉素对U87细胞株的IC50
[0042] 本发明为进一步研宄脑胶质瘤的耐药机制、逆转脑胶质瘤耐药建立了可靠模型， 建立的耐药细胞株的耐药系数高，且耐药细胞株的耐药稳定性很好。
[0043] 实施例2
[0044] 发明人在人星形胶质瘤细胞株U87R-D0X建立过程中，平行实验得到另一耐阿霉 素 U87细胞模型U87R-D0X'，其IC50为685ng/ml，耐药系数（48小时）为20. 15,耐药系数 (1个月）为14. 32,耐药系数（6个月）为12. 80。耐药性和耐药稳定性均显著差于人星形 胶质瘤细胞株U87R-D0X。
[0045] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种耐阿霉素U87细胞模型，其特征在于，所述的耐阿霉素U87细胞模型的保藏号为 CCTCC C201531。2. 权利要求1所述的耐阿霉素U87细胞模型的用途，其特征在于，用于研宄脑胶质瘤耐 药机制、寻找脑胶质瘤耐药逆转的靶点、筛选治疗脑胶质瘤或解除脑胶质瘤耐药的药物。3. 权利要求1所述的耐阿霉素U87细胞模型的用途，其特征在于，用于脑胶质瘤引起的 难治性癫痫的机制研宄、寻找脑胶质瘤引起的癫痫的耐药逆转靶点、筛选治疗脑胶质瘤引 起的癫痫或解除脑胶质瘤引起的癫痫耐药的药物。4. 权利要求1所述的耐阿霉素U87细胞模型的建立方法，其特征在于，它包括以下步 骤： a) 培养U87细胞； b) U87细胞用阿霉素开始干预，然后换无阿霉素培养基，至细胞生长恢复正常即细胞稳 定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30%的情况下3至5天可长至90%后再开始 正常传代并提高阿霉素的浓度，每次阿霉素的干预时间均为24小时； c) 对干预后的U87细胞进行检测，获得耐阿霉素U87细胞模型。
【专利摘要】本发明涉及一种耐阿霉素U87细胞模型及其应用。本发明用阿霉素干预U87细胞，然后换无阿霉素培养基，至细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高阿霉素的浓度，每次阿霉素的干预时间均为24小时，最后对干预后的U87细胞进行检测，获得耐阿霉素U87细胞模型，其保藏号为CCTCC NO：C201531。该细胞模型耐药性强，耐药系数高，且耐药稳定性很好，可用于研究脑胶质瘤耐药机制、寻找脑胶质瘤耐药逆转的靶点、筛选治疗脑胶质瘤或解除脑胶质瘤耐药的药物，也可用于肿瘤引起难治性癫痫的机制研究、寻找癫痫耐药逆转的靶点、筛选治疗癫痫或解除癫痫耐药的药物。CCTCC NO：C20153120150401
【IPC分类】C12Q1/02, C12N5/09
【公开号】CN104946593
【申请号】CN201510215901
【发明人】邵一叶, 陈英辉
【申请人】复旦大学附属金山医院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年4月30日