重组溶瘤腺病毒及其应用

文档序号:9230998阅读:907来源:国知局
重组溶瘤腺病毒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和基因治疗领域,具体地说,涉及一种新型的重组溶瘤腺病 毒及应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤的发展是多因素参与的动态过程,多年来对肿瘤基因治疗研宄的经验表 明,怎样在与恶性肿瘤的竞速中取得完胜是实现有效治疗的关键。因此,应以恶性肿瘤发 生、发展过程中的多因素、特殊性为切入点,使抑瘤过程达到动态平衡,最终实现准确快速 抑瘤,有效治疗恶性肿瘤。
[0003] 手术治疗、化疗和放疗是目前肿瘤治疗的首选方式,但会对机体造成不可逆创伤 和生理的次生影响,且根治不完全。因此,在抗肿瘤新方法研宄伊始,即应摒弃拆东补西的 传统方案,通过将特异性作为研宄重点达到候选药物的安全性、特异性和有效性。
[0004] 多数化疗药物和射线通过p53基因发挥作用,而各类肿瘤中50~60%存在p53基 因突变,从而严重影响治疗效果。另外,bcl-2基因可抑制细胞凋亡,因此成为一些肿瘤化 疗耐药的物质基础。因此,探索不依赖P53且不受bcl-2基因影响的新型抗肿瘤生物效应 物质,从根本上解决某些恶性肿瘤患者的耐药问题,成为亟待解决的问题。
[0005] 恶性肿瘤超过100种,几乎可以发生在机体的任何部位。全世界70%的恶性肿瘤 死亡病例发生在中低收入国家,发达国家以不计成本的方式治疗只能将个别恶性肿瘤类型 的5年平均生存率提高至50~60%。宫颈癌、乳腺癌和结肠癌等恶性肿瘤,若发现及时, 辅以适当疗法,可以得到有效治疗。由于目前的公共卫生水平、医疗质量和诊治费用等诸多 限制,将使极易控制的恶性肿瘤也难以得到有效治疗,最终使中国成为名副其实的"癌症大 国"。因此,在研发抗肿瘤候选药物过程中,应充分考虑生产成本和患者承受能力。
[0006] 近年来,以基因治疗、体细胞治疗、抗体治疗和生物化疗为研宄重点的肿瘤生物治 疗发展迅速,其中又以基因治疗研宄最为广泛。基因治疗载体主要包括非病毒载体和病毒 载体两类。非病毒载体副作用小,但低下的转导效率和瞬时表达的特点使其发展受限。因 此,75%以上的基因治疗研宄应用病毒载体。肿瘤基因治疗的成功不仅在于其有效性,特异 性也是重要的评测指标之一。在很多永生化细胞系中发现一些基因拷贝数增加,说明存在 肿瘤特异性启动子。肿瘤特异性启动子可在肿瘤细胞内驱动基因高水平表达,提示该类启 动子的高效性和特异性适用于在肿瘤细胞中靶向表达,为肿瘤基因治疗的临床应用提供了 新策略。
[0007] 凋亡素是来源于鸡贫血病病毒的一种小分子蛋白。凋亡素能够在不影响正常细胞 的前提下,特异性地诱导多种肿瘤细胞凋亡。另外,多数化疗药物和射线是通过野生型P53 诱导细胞凋亡的,而50~60%的肿瘤类型存在p53基因突变,因此严重影响治疗效果。研 宄发现,无论肿瘤细胞的P53基因是否存在突变,凋亡素能够有效地诱导肿瘤细胞凋亡。另 外,bcl-2基因的过表达可抑制细胞凋亡,因此bcl-2的过表达也成为一些肿瘤细胞对化疗 药物产生耐药性的重要物质基础。而研宄发现,bcl-2基因的过表达不仅对凋亡素的凋亡 诱导作用无影响,反而能增强其凋亡诱导功能。这种促进作用不是二者直接作用的结果,因 为即使正常细胞过表达bcl-2,凋亡素也不会对其产生影响。因此,凋亡素可以有效地避免 耐药性的产生。

【发明内容】

[0008] 本发明的目的是提供一种新型的重组溶瘤腺病毒,用于肿瘤的治疗。
[0009] 本发明的另一目的在于提供重组溶瘤腺病毒在制备和治疗肿瘤药物方面的应用。
[0010] 本发明提供的重组溶瘤腺病毒,包括溶瘤腺病毒载体和插入其中的表达盒,所述 表达盒包括由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)与Ela基因组成的表达盒以及由真核启 动子与鸡贫血病病毒VP3基因组成的表达盒。
[0011] 其中,所述鸡贫血病病毒VP3基因,第209位核苷酸由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,第 347位核苷酸由鸟嘌呤突变为腺嘌呤,第352位核苷酸由胸腺嘧啶突变为胞嘧啶,其核苷酸 序列如Seq ID No. 1所示。
[0012] 所述人端粒酶逆转录酶启动子,其第220位核苷酸为胞嘧啶,第266位核苷酸为鸟 嘌呤,第268位核苷酸为鸟嘌呤,其核苷酸序列如Seq ID No. 2所示。
[0013] 本发明采用突变的VP3基因,有效提高了其抗肿瘤能力,采用突变的人端粒酶逆 转录酶启动子,有效提高了其稳定性。
[0014] 本发明中使用的真核启动子优选为人类巨细胞病毒启动子,所述溶瘤腺病毒载体 源自人5型腺病毒。
[0015] 优选地,本发明的重组溶瘤腺病毒,由溶瘤腺病毒载体、人端粒酶逆转录酶启动 子、Ela基因、人类巨细胞病毒启动子、鸡贫血病病毒VP3基因和多聚腺苷酸序列组成。
[0016] 更优选地,本发明的重组溶瘤腺病毒,其序列如Seq ID No. 3所示。
[0017] 本发明还提供所述重组溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物和预防术后肿瘤复发药物中 的应用。
[0018] 本发明进一步提供由所述重组溶瘤病毒制备的抗肿瘤药物和预防术后肿瘤复发 药物。所述药物可制备成注射剂、喷雾剂或涂抹剂等剂型。
[0019] 本发明提供的新型重组溶瘤病毒具有肿瘤特异性复制和肿瘤特异性杀伤的双重 特异性,可以在肿瘤细胞内特异性复制,同时表达对肿瘤细胞具有特异性杀伤能力的凋亡 素基因,从而通过增强肿瘤特异性提高其安全性。同时,通过重组溶瘤病毒的复制和凋亡素 基因本身的杀伤能力,提尚其肿瘤杀伤能力。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例3中72小时MTT实验检测不同浓度抑制结果。
[0021] 图2为本发明实施例3中100M0I时MTT实验检测不同时间抑制结果。
[0022] 图3为本发明实施例4中模型动物肿瘤生长趋势实验结果。
[0023] 图4为本发明实施例4中模型动物平均存活期实验结果。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中大肠杆菌感受态细胞的 制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组 质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎孟楓等译《分子克隆实验指南》第二版相 关章节进行。
[0025] 实施例1重组溶瘤腺病毒穿梭载体质粒的制备
[0026] UEla基因的克隆
[0027] 根据GenBank中公开的人5型腺病毒Ela基因序列(NC_001406),设计如下引物, 用于扩增Ela基因:
[0028] Ela 上游引物:5' -GCCTGCAGACCACCATGGGACATATTATCTGCCAC-3'
[0029] Ela 下游引物:5' -GCGGATCCTTATGGCCTGGGGCGTTTACAGC-3'
[0030] 优化各步反应条件及参与反应试剂的最佳浓度,在PCR仪上进行DNA扩增。反应总 体积50 μ L : 10 XPCR缓冲液5 μ L、20 μ mol/L上。下游引物各1 μ L,模板DNA5 μ UdNTP (各 2.5mmol/L)5yL,25mmol/L MgCl24yL,lU/yL Ex-Taq DNA 聚合酶 IyUddH2O 27yL。筛选 并确定 PCR 工作程序:94°C 4min ;然后 94°C 30s,57°C 45s,72°C lmin,10 个循环;最后 72°C 延伸lOmin,4°C保温。扩增产物分别连接至pMD18-T载体上,并对所构建的质粒pMD18-Ela 进行核苷酸序列测定。
[0031] 2、VP3基因的克隆
[0032] 根据GenBank中公开的VP3基因序列(NC_001427),设计如下引物,将第209位核 苷酸由胞嘧啶突变为胸腺嘧啶,第347位核苷酸由鸟嘌呤突变为腺嘌呤,第352位核苷酸由 胸腺嘧啶突变为胞嘧啶,用于扩增VP3基因:
[0033] Apoptin 上游引物:5' -GCGATATCACCACCATGGACGCTCTCCAA-3'
[0034] Apoptin 下游引物:5' -GCGAATTCTTACAGTCTTATACGCCTTTTTGCGGTTCGGGGTCGGCTGG GAGTAGTGGTAATCAAGCTTTCTTTTAGCTCGCTTACCCTGTACTCGGAGGGGTCGCAGGATCGCTTCTTCGAGGGA GGCTTGGGTTGATCGGTCCTCAAGTCCGGCACATTCTTGAAACCA-3 ,
[0035] 优化各步反应条件及参与反应试剂的最佳浓度,在PCR仪上进行DNA扩增。反应总 体积50 μ L : 10 X PCR缓冲液5yL、20ymol/L上、下游引物各lyL,模板DNA5 μ UdNTP (各 2.5mmol/L)5yL,25mmol/L MgCl24yL,lU/yL Ex-Taq DNA 聚合酶 IyUddH2O 27yL。筛选 并确定 PCR 工作程序:94°C 4min ;然后 94°C 30s,57°C 45s,72°C lmin,10 个循环;最后 72°C 延伸lOmin,4°C保温。扩增产物分别连接至pMD18-T载体上,并对所构建质粒pMD18-VP3进 行核苷酸序列测定。
[0036] 3、肿瘤特异性启动子的合成
[0037] 分别根据GenBank中公开的人端粒酶逆转录酶启动子hTERT(EU650197)核苷酸序 列人工合成hTERT启动子,第220位核苷酸为胞嘧啶,第266位核苷酸为鸟嘌呤,第268位 核苷酸为鸟嘌呤,并将其连接于PKS载体(购自Stratagen公司),构建含有hTERTp的质粒 pKS-hTERT。
[0038] 4、穿梭质粒的构建
[0039] Pst I/BamH I双酶切质粒pMD18-Ela,获得Ela基因片段,并与经同样双酶切的质 粒pKS-hTERTp连接,构建质粒pKS-hTERTp-El。然后Xba I/Xho I双酶切质粒pIRES-neo (购 自Invitrogen公司),获得Poly A核苷酸片段,补平,与经Hind III酶切并补平的 pKS-hTERTp-El 连接,构建质粒 pKS-PolyA-hTERTp-El。
[0040] Hind III 酶切质粒 pacAd5CMV K-N pA,补平后用 EcoR I 酶切,与经 EcoR I/EcoR V双酶切PMD18-VP3后获得的VP3基因片段连接,构建质粒pAd-VP3。
[0041] BamH I酶切pAd-VP3,补平后用Spe I酶切,回收线性化的pAd-VP3 ;Xho I酶 切pKS-PolyA-hTERTp-El,补平后用Spe I酶切,获得含-PolyA-hTERTp-Ela核
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