基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学分子生物学领域，具体涉及一种基于Illumina Hiseq 2500测序 平台的小片段DNA文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 染色体非整倍体是指相对于人的正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几 条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切的关系。新生儿中 染色体异常的发病率为1/160,其中21-三体（唐氏综合征）、18-三体（爱德华氏综合征） 和13-三体（帕陶氏综合征）是三种最主要常染色体非整倍体疾病，在新生儿中发病率分 别为1/800、1/6000和1/1000。目前此类疾病尚无有效治疗方法，正能通过产前诊断减少患 儿的出生。
[0003] 在该类疾病现有的检测方法中，利用第二代高通量测序技术对胎儿染色体非整 倍体进行检测的方法具有明显的优势。第一，只需抽取母体外周血进行检测，避免了传统 的侵入性方法可能会对孕妇和胎儿带来的危害；第二，直接检测染色体上的DNA序列即直 接致病因素，与用血清蛋白标记物和超声波进行检测的方法相比，检测的准确性和灵敏度 都大大提高；第三，通过深度测序，实现了对孕妇外周血中少量胎儿游离DNA(cell-free fetalDNA, cffDNA)的准确检测，克服了传统检测方法因胎儿游离DNA的含量过低而呈现搞 得假阴性率的缺点。
[0004] 高通量测序技术又称为下一代测序技术、以能一次并行对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定和读长较短等为标志。第二代高通量illumina测序平台具有测序通量 高、准确度高和成本低等优点，并广泛应用于多个领域。在高通量检测方法的整个流程中， 游离DNA文库的制备是非常关键的一步，文库质量的好坏将直接影响测序数据的质量，并 影响检测结果的准确性。
[0005] 现有技术中基于Illumina Hiseq2500测序平台的文库构建方法主要包括以下步 骤：
[0006] 1、将DNA打断到一定的大小并纯化；
[0007] 2、对DNA片段进行末端修复并纯化；
[0008] 3、在已修复的DNA片段的3'端加上一个"A"碱基并纯化；
[0009] 4、用DNA连接酶将特异性接头连接至DNA片段的两端，纯化；
[0010] 5、对加接头的DNA序列进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收一定大小的片段，纯化； [0011] 6、采用PCR方法扩增DNA文库，纯化。
[0012] 用Agilent Bioanalyzer2100和Q-PCR检测上述构建文库的片段大小及浓度，之 后使用Illumina测序平台进行高通量测序。上述基于illumina测序平台的文库构建方法 存在自身的局限性：第一，上述小片段DNA文库构建流程繁琐，操作过程复杂，建库所花费 的时间长；第二，上述建库流程中，各个步骤需相互独立进行制备且都需要进行纯化，这就 造成了 DNA文库样品不可避免的损失和浪费，不适用于DNA量少的样本或其他珍惜样本的 检测；第三构建文库所用试剂的种类繁多，使得整个构建文库的过程的成本增加。
【发明内容】
[0013] 本发明目的是提供一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的 构建方法，以降低建库成本和缩短建库时间。
[0014] 本发明采用以下技术方案：
[0015] 本发明第一方面提供了一种基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文 库的构建方法，包括如下步骤：
[0016] (1)血液游离DNA提取：采用磁珠法从样品中提取血液游离DNA ;
[0017] (2)片段大小筛选：利用磁珠对步骤（I)DNA进行片段大小筛选及纯化；
[0018] (3)末端修复：将步骤⑵得到的DNA与试剂1混合，在PCR仪上按22°C 20min， 72°C 20min的程序进行孵育反应；
[0019] (4)3,端添加接头：将步骤（3)所得的反应体系与试剂2混合，在PCR仪上 22°C 15min，72°C 20min的程序进行孵育反应；之后磁珠纯化；
[0020] (5) PCR扩增：将步骤（4)得到的DNA片段加入试剂3进行PCR扩增；
[0021] (6)磁珠纯化：将步骤（5)所得扩增产物利用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文 库；
[0022] 其中，步骤（3)所述试剂1的pH值为7. 5,成分为去离子水、50mM Tris-HClUOmM MgCl2、IOmM 二硫苏糖醇、ImMγ_32ρ_ΑΤΡ、IOmM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶；
[0023] 步骤（4)所述试剂2的pH值为L 6,成分为去离子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA 连接酶、IOmM MgCl2、50mM Tris-HCl、50wt%甘油、ImM ATP、5mM dNTPs ;
[0024] 步骤（5)所述试剂3的pH值为L 6,成分为去离子水、IOOmM Tris-HCl、5mM MgCl2、 250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA 聚合酶和 12.5mM 引物混合液。
[0025] 步骤（1)所述样品为孕12-24周的孕妇外周血的血浆。
[0026] 步骤（1)采用试剂盒提取DNA，所述试剂盒为金麦格血清游离DNA提取试剂盒。
[0027] 步骤⑵和步骤（6)所述磁珠为AMPure XP磁珠，筛选的DNA片段大小范围是 250_350bp。
[0028] 步骤（4)所述DNA Adapter为正反两个序列组成Y字的接头，接头的序列分别为：
[0029] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0030] 5 ' -GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
[0031] 其中XXXXXX表示标签接头序列，选自SEQ ID N0:2-49,如下表所示：
[0032]
[0033] 步骤（5)中PCR扩增所使用的引物序列为：Primer 1如SEQ ID NO: 50所示：5'AA TGATACGGCGACCACCGAGATATACAC3'，Primer 2 如 SEQ ID N0:51**:5'CAAGCAGAACACGGCAT ACGAGAT3'。
[0034] 本发明第二方面提供了一种小片段DNA文库，其由上述任一方法构建。
[0035] 本发明第三方面提供了一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小 片段DNA文库的末端修复反应试剂，其pH值为7. 5,成分为去离子水、50mM Tris-Hcl、IOmM MgCl2、10mM 二硫苏糖醇、lmMy-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶。
[0036] 本发明第四方面提供了一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片 段0嫩文库的接头反应试剂，其？!1值为7.6，成分为去离子水、251^0嫩4(1?丨從、20(^/111 T4DNA 连接酶、IOmM MgCl2、50mM Tris-HCl、50wt%甘油、ImM ATP、5mM dNTPs。
[0037] 本发明第五方面提供了一种用于构建基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小 片段DNA文库的PCR扩增反应试剂，其pH值为7. 6,成分为去离子水、IOOmM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA 聚合酶和 12.5mM 引物混合液。
[0038] 本发明的有益效果：
[0039] 与以往基于测序平台的建库流程相比，本发明建库方法简化了实验流程，缩短建 库时间，优化了反应体系，大幅度的减少试剂用量，降低建库成本，并降低了文库的损失，适 用于人为片段化的小DNA文库的构建。
【附图说明】
[0040] 图1 :本发明小片段DNA文库的构建流程图。
[0041] 图2 :采用Agilent Bioanalyzer 2100对本发明文库的检测结果图。
[0042] 图3 :文库测序数据质检结果图。
【具体实施方式】
[0043] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰，也同样落入本发明的保护范围之内。
[0044] 实施例1 :基于Illumina Hiseq 2500测序平台的小片段DNA文库的构建。
[0045] 1、试剂
[0046] 试剂1其pH值为7. 5,成分为去离子水、50mM Tris-HClUOmM MgCl2、10mM二硫苏糖 醇（DTT)、lmMy-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ ul T4多聚核苷酸激酶。
[0047] 试剂2其pH值为L 6,成分为去离子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA连接酶、 IOmM MgCl2、50mM Tris-Hcl、50wt%甘油、ImM ATP、5mM dNTPs。
[0048] 试剂3其pH值为7· 6,成分为去离子水、IOOmM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、 10U/ul Tap DNA聚合酶和12. 5mM引物混合液。
[0049] 2、实验步骤
[0050] (1)采集母体外周血，制备血浆
[0051] 在本实施例中，总共抽取48名孕妇外周血，编号为：ST01、ST02、ST03、ST04、ST05、 ST06、ST07、ST08、ST09、ST10、ST11、ST12、ST13、ST14、ST15、ST16、ST17、ST1