一种向日葵黄萎病的两种轮枝病菌的多重dpo-pcr检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种向日葵黄萎病的两种轮枝病菌的多重 DPO-PCR检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 向日葵黄萎病主要是由大丽轮枝菌（Vertieillium dahliae Kleb.)和黑白轮枝 菌（Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold)引起，虽然有报道称从向日葵黄萎病 株上分离的大部分是大丽轮枝菌，但仍有报道证明黑白轮枝菌也是引起向日葵黄萎病的一 种重要病原菌。大丽轮枝菌和黑白轮枝菌均为我国进境检疫性有害生物，亲缘关系非常近， 两种菌的ITS序列同源性高达99. 40 %。因此对分离自向日葵黄萎病株的两种真菌类别进 行鉴定显得非常重要，而传统形态学方法鉴定这两种菌周期长、时效性差。利用血清学和分 子生物学技术鉴定这两种菌的方法已有建立，包括PCR、RFLP、RAPD等。但这些方法有些需 要酶切，检测过程复杂；有些特异性不强或对依赖较昂贵的仪器设备，都难以在实验室之间 推广。因此，建立一种特异性强、且能同时快速区分这两种菌的检测方法显得非常重要。
[0003] DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各 自独立的特异性引物区域，5'端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3'端序 列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄 嘌呤（In 〇Sine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄 嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5'和3'区域形两个独立功能的双特异性引物结构，并 且研宄表明5'和3'引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，而 且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感。该 技术的优点主要在于它对退火温度、镁离子浓度等影响普通多重PCR的关键因素不敏感， 适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率高，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是如何检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝 菌还是大丽轮枝菌的引物组。
[0006] 本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的引物组 由引物1、引物2、引物3和引物4组成：
[0007] 所述引物1为SEQ ID No. 1所示的单链DNA分子；
[0008] 所述引物2为SEQ ID No. 2所示的单链DNA分子；
[0009] 所述引物3为SEQ ID No. 3所示的单链DNA分子；
[0010] 所述引物4为SEQ ID No. 4所示的单链DNA分子。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝 菌还是大丽轮枝菌的PCR试剂。
[0012] 本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的PCR试 剂包括上述引物组。
[0013] 上述PCR试剂，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR试剂 中的终浓度均为〇· 4 μ mol/L〇
[0014] 为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝 菌还是大丽轮枝菌的试剂盒。
[0015] 本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的试剂盒 包括上述引物组或上述PCR试剂。
[0016] 上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测菌株是黑白轮 枝菌还是大丽轮枝菌中的应用也属于本发明的保护范围。
[0017] 上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在区分或辅助区分黑白轮枝菌和大丽 轮枝菌中的应用也属于本发明的保护范围。
[0018] 为解决上述技术问题，本发明最后还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是黑白 轮枝菌还是大丽轮枝菌的方法。
[0019] 本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌包括如下 步骤：
[0020] (1)用上述引物组对待测菌株进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0021] (2)检测所述PCR扩增产物的大小；
[0022] 若所述PCR扩增产物含有大小为151bp的片段，则待测菌株为或候选为黑白轮枝 菌；
[0023] 若所述PCR扩增产物含有大小为225bp的片段，则待测菌株为或候选为大丽轮枝 菌。
[0024] 上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA ;所述待测菌株来源于 向日葵、苜蓿、棉花、前子、番茄、辣椒或马铃薯。
[0025] 上述方法中，所述PCR扩增为多重DP0-PCR。
[0026] 上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为45-65°C。
[0027] 上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为60°C。
[0028] 上述方法在检测或辅助检测黄萎病的病菌中的应用也属于本发明的保护范围。
[0029] 上述应用中，所述病菌为黑白轮枝菌和大丽轮枝菌。
[0030] 上述应用中，所述病菌来源于向日葵、苜蓿、棉花、茄子、番茄、辣椒或马铃薯。
[0031] 本发明选择引起向日葵黄萎病的两种轮枝菌一一黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的 β-tubulin基因为靶基因，设计特异性DPO引物，并基于该引物建立了黑白轮枝菌和大丽 轮枝菌的多重DPO-PCR检测方法，可对向日葵黄萎病病原分离株进行定性检测。通过试验 证明：本发明的特异性DPO引物特异性好，灵敏度高，而且对退火温度不敏感，适用范围广， 并基于该特异性DPO引物发明了一种可以准确、简便和快速鉴别检测黑白轮枝菌和大丽轮 枝菌的多重DPO-PCR方法，对进出口相关货物及产品检验检疫、病害防治预测具有指导意 义。
【附图说明】
[0032] 图1为多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测结果。其中，1 :大丽轮枝菌、黑白轮枝 菌；2 :黑白轮枝菌；3 :大丽轮枝菌；4 :阴性对照。
[0033] 图2为特异性实验的电泳检测结果。其中，1 :大丽轮枝菌、黑白轮枝菌；2 :黑白 轮枝菌；3 :大丽轮枝菌；4 :向日葵白锈病菌；5 :向日葵黑茎病菌；6 :向日葵茎溃疡病菌；7 : 向日葵霜霉病菌；8 :向日葵菌核病菌；9 :向日葵褐斑病菌；10 :向日葵锈病菌；11 :向日葵 炭腐病菌；12:阴性对照。
[0034] 图3为退火温度敏感实验的电泳检测结果。其中，1-5 :退火温度分别为45°C、 50°C、55°C、60°C和 65°C。
[0035] 图4为灵敏度实验的电泳检测结果。其中，1-6 :2种病原菌DNA模板量依次为 50ng、5ng、0. 5ng、0. 05ng、0. 005ng 和 0· 0005ng。
【具体实施方式】
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 下述实施例中的黑白轮枝菌（Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold) 在文献"检疫性轮枝菌及其近似种的检测"中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获 得。
[0039] 下述实施例中的大_轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb.)在文献"检疫性轮枝 菌及其近似种的检测"中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。
[0040] 实施例1、一种检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的方法
[0041] 一、多重DPO-PCR引物的设计
[0042] 以黑白轮枝菌（伊犁出入境检验检疫局）和大丽轮枝菌（伊犁出入境检验检 疫局）的β-tubulin基因为靶基因，设计了如下检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的多重 DPO-PCR检测引物组（I为次黄嘌呤）：
[0043] 上游引物 Va-DPO-F :CCCTAACGGGTCGTTTCTTTTCTGIIIIICGGGTACT (序列 1);
[0044] 下游引物 Va-DPO-R :GCAAATGCTGCTGAGAGATATCCAIIIIICCGTTTTA(序列 2);
[0045] 上游引物 Vd-DPO-F :GAATCACGTTGTCCCGACCTCIIIIICGATCACG(序列 3);
[0046] 下游引物 Vd-DPO-R :GCAGCACCGATCTGGTTACCCTGIIIITCCAGTGAT (序列 4);
[0047] 其中，Va-DPO-F和Va-DPO-R为检测黑白轮枝菌的引物，产物大小为151bp ; Vb-DPO-F和Vb-DPO-R为检测大丽轮枝菌的引物，产物大小为225bp。
[0048] 二、检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的方法
[0049] UDNA 的提取
[0050] 参照DNA提取试剂盒操作（植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02,天根生 物科技有限公司）分别提取黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA。
[0051] 2、多重 DPO-PCR 扩增
[0052] 采用 Va-DP〇-F、Va-DP〇-R、Vd-DP〇-F、Vd-DPO-R 共 4 条多重 DPO-PCR 引物，分别以 如下四组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR扩增产物：
[0053] 组1 :以黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA(黑白轮枝菌和大丽轮枝菌各 1 μ U为模板；
[0054] 组2 :以黑白轮枝菌的基因组DNA为模板；
[0055] 组3