玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物分子标记领域，具体涉及玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分 子标记，以及该核不育基因分子标记的应用。
【背景技术】
[0002] 玉米核不育又称为基因雄性不育（Male Sterility，简写为MS或ms)，是 指由细胞核基因控制的雄性不育。自1921年Eyster (Eyster L. A.，Journal of Heredity，1921. 12:138-141)发现玉米核不育基因以来，到目前为止已报道的核不育基因 有92个（孙庆泉等.植物学通报.2003. 20 (2): 248-2530)。但是由于核不育基因的杂交后 代中总有育性的分离，因此，玉米核不育很难在玉米生产中直接应用。
[0003] 摩擦禾（Tripsacum)是玉米（Zea mays)的近缘属，具有抗病虫、优质、无融 合生殖特性等优点，但是由于玉米与摩擦禾之间存在的生殖隔离，将摩擦禾中的有益 性状导入玉米的远缘杂交很难成功。20世纪30年代以来，通过一些特殊手段成功创 制了 摩擦禾与玉米的杂种（Mangelsdorf 等· Heredity. 1931. 22:329-343 ;Leblanc 等.Heredity. 1996. 87(2):108-111 ;Sokolov 等·Genetika. 1998. 34:499-506)，并在 连续回交的衍生后代中获得了系列包含整套玉米染色体和一条额外摩擦禾染色体的玉 米-摩擦禾单体附加系，其中有2个玉米摩擦禾单体附加系被稳定地保存下来（Marjorie. Genetics. 1963.48:1185-1194)。玉米摩擦禾单体附加系220B(引自美国USDA)即为其 中一个，在正常全套玉米染色体的基础之上额外附加了一条易位的摩擦禾染色体，植株 生长正常，但是雄穗发育异常，花粉可染率仅为4%，基本不育且不散粉，而雌穗发育正常 (Marjorie…Genetics. 1957. 42:473-486 ;李志龙·四川农业大学硕士论文· 2011)。200B 存在的花粉败育不彻底问题，限制了该材料的应用。
[0004] 分子标记辅助选择（Marker-assisted selection，MAS)是指借助分子标记对目标 性状进行选择。分子标记辅助选择不受时间和环境条件的限制，可以直接对性状的基因型 进行选择，提高了育种效率，缩短了育种进程，因而越来越受到育种者的重视和应用。目前 公开了一些与核不育基因连锁的分子标记如RFLP、AFLP、SCAR、SSR等（梁业红等.作物学 报.2000. 26(3) :266-271 ;刘福霞等.遗传学报.2005. 32(7) :753-757 ;李式昭等.高技术 通讯· 2007. 17(8) :869-873 ;李玉玲等.河南农业大学学报· 2008. 42(3) :245-249, 254 ;张 琳碧等.玉米科学.2012. 20 (5) : 50-53, 58)，有些分子标记已在核不育后代选择中得到应 用，节省了大量的人力、物力，并加快了育种进程。
[0005] 经检索，没有发现将分子标记用于玉米摩擦禾单体附加系核不育基因辅助选择的 报道。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记。
[0007] 本发明另一目的在于提供用于扩增上述分子标记的SCAR引物对。
[0008] 本发明第三目的在于提供用于检测上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因分子 标记的试剂盒。
[0009] 本发明第四目的在于提供上述分子标记在玉米摩擦禾单体附加系核不育基因辅 助选择上的用途。
[0010] 本发明第五目的在于提供利用上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标 记回交转育玉米雄性不育系的方法。
[0011] 本发明第六目的在于提供利用上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标 记进行玉米轮回选择育种的方法。
[0012] 本发明第七目的在于提供利用玉米摩擦禾单体附加系回交转育玉米雄性不育系 的方法。
[0013] 本发明第八目的在于提供利用玉米摩擦禾单体附加系进行玉米轮回选择育种的 方法。
[0014] 实现本发明的技术方案如下：
[0015] 本发明一种玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记，命名为Mstl，所述的 分子标记由SEQ ID No :1所示的核苷酸序列组成。
[0016] 上述分子标记中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或其带有附加染色体 的MTchr2的衍生系。
[0017] 上述分子标记中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指玉米（Zea mays)MTchr2,已于 2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏地址为：北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所），保藏编号为：CGMCC No. 9552。
[0018] 所述的玉米摩擦禾单体附加系（或简称为：单体附加系）MTchr2是由美国USDA引 进的玉米摩擦禾单体附加系220B(编号：220B)改良获得；其中含有21条染色体的为玉米 摩擦禾单体附加系（2n = 20+1)，该玉米摩擦禾单体附加系除了含有来自玉米的20条常规 染色体外，还有一条玉米第2号染色体与摩擦禾染色体易位的附加染色体，其花粉完全败 育，所述的核不育基因即位于该易位的附加染色体上；其次，提交保藏的MTchr2中还有由 20条常规染色体（2n = 20)组成的普通玉米，其花粉完全可育。
[0019] 本发明所述的玉米摩擦禾单体附加系玉米（Zea mays)MTchr2的培育过程：（一）、 材料引进及研宄：2007年从美国USDA引进玉米摩擦禾单体附加系220B(编号：220B)。该 单体附加系中含有21条染色体的为玉米摩擦禾单体附加系（2n = 20+1)，在正常全套玉米 染色体的基础之上额外附加了一条玉米与摩擦禾易位的染色体，其植株生长正常，但是雄 穗发育异常，花粉可染率仅为4%，基本不育且不散粉，而雌穗发育正常，可以通过杂交正常 结实，这种雄性不育的性状紧密伴随着附加的染色体，说明在这条附加的易位染色体上存 在一个显性基因控制着花粉育性（Marjorie. · Genetics. 1957. 42:473-486 ;李志龙·四川 农业大学硕士论文.2011)。不育性状通过杂交可以在后代中传递，平均传递率为46% (李 志龙，四川农业大学硕士论文.2011)。前人所发现的玉米核不育基因均存在于玉米基因 组中，而玉米摩擦禾单体附加系220B中的核不育基因独立于玉米整套的基因组而存在于 附加的染色体上，因此，在回交转育中可以很好地实现遗传背景的替换，排除与玉米基因组 中基因的连锁累赘。（二）MTchr2的育种过程：2012年3月将220B种植于四川省雅安市， 2012年6月在抽丝散粉期选择花粉几乎完全不育的玉米摩擦禾单体附加系220B单株作为 母本，玉米自交系M〇17作为父本杂交，获得杂种F1代；2012年10月将每个单株获得的单 个果穗作为一个株系在云南西双版纳基地进行种植，利用根尖染色体压片技术鉴定每个株 系中的玉米摩擦禾单体附加系植株，计算传递率，抽雄期通过花粉育性检测发现花粉可染 率为〇%，完全败育；以杂种F 1代中附加染色体传递率高的玉米摩擦禾单体附加系单株（2n =20+1)作为母本，玉米自交系M〇17作为父本回交，获得的回交一代材料，经检测，其所得 的单体附加系（2n = 20+1)的花粉败育率100%，命名为MTchr2。其中包含有21条染色体 的玉米摩擦禾单体附加系种子（2n = 20+1)和20条染色体的普通玉米（2n = 20)。相对于 原始的玉米摩擦禾单体附加系220B，MTchr2植株整体长势更好，单体附加系MTchr2植株花 粉败育率比220B更彻底，其败育率为100%。
[0020] 上述分子标记中所述的核不育基因 Mstl，该基因位于附加的玉米摩擦禾易位染色 体上。
[0021] 本发明用于扩增上述分子标记的SCAR引物对，由SEQ ID No :2(命名为：Mstl-F) 和SEQ ID No :3(命名为：Mstl-R)所示的核苷酸序列组成；其核苷酸序列分别为：
[0022] Mstl-F:5'-GTAGCAGTTACACATCAAAATCCG-3' （SEQ ID No :2);
[0023] Mstl-R:5'-TGTCTTGCTTATACCCATCTAAAGG-3' （SEQ ID No :3)。
[0024] 本发明用于检测上述分子标记的试剂盒，含有由SEQ ID No :2 (Mstl-F)和SEQ ID No :3 (Mstl-R)所示的核苷酸序列组成的SCAR引物对。
[0025] 上述试剂盒，还包括 Taq 聚合酶、MgCl2、dNTPmix、10XTaq Buffer 和 ddH20。
[0026] 上述分子标记在玉米摩擦禾单体附加系核不育基因辅助选择上的应用。
[0027] 利用上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记回交转育玉米雄性不育 系的方法，包括如下步骤：
[0028] (1)、种植玉米摩擦禾单体附加系，同时分批种植农艺性状优良的玉米自交系； 在5~6叶期提取玉米摩擦禾单体附加系叶片基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以 Mst I-F和Mst I-R为引物进行PCR扩增，电泳，保留带有Mst 1标记的植株，拔除不带Mst 1标 记的植株；在抽丝散粉期，以带有Mstl标记的植株（2n = 20+1)为母本，以农艺性状优良的 玉米自交系（2n = 20)为父本杂交，得杂交F1代；
[0029] (2)、种植杂交匕代，同时分批种植步骤（1)中所述的农艺性状优良的玉米自交 系；按照步骤（1)中所述的方法对F1代植株进行PCR扩增，保留带有Mstl标记的植株，拔 除不带Mstl标记的植株；在抽丝散粉期，用农艺性状优良的玉米自交系给带有Mstl标记的 F1代植株（2n = 20+1)授粉，得BC ；
[0030] (3)、重复步骤⑵连续回交4~6次，即得含有21条染色体的相应农艺性状优良 的玉米自交系的不育系；所得的不育系的植株表型与步骤（1)中的农艺性状优良的玉米自 交系基本相同，但花粉完全败育；此外，还同时产生相应的含有20条染色体的花粉可育的 常规种子。
[0031] 上述方法步骤（1)中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或带有附加染色 体的MTchr2的衍生系。
[0032] 上述方法步骤（1)中所述的玉米自交系是指生产上广泛应用的农艺性状优良的 自交系，如B73、郑58或昌7-2等，这属于本领域技术人员熟知的常识。
[0033] 上述方法步骤（1)中所述的PCR扩增的反应体系为：