用于扩增襀翅目昆虫线粒体coi基因的特异性引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一对用于扩增櫝翅目昆虫线粒体细胞色素 C氧化酶I (cytochrome c oxidase I ;C0I)基因的特异性引物。
【背景技术】
[0002] 櫝翅目（Plecoptera)又称石蝇，该类昆虫在除南极以外的世界各大陆上均有分 布，但主要分布于东洋区、古北区及新北区，尤以横跨古北和东洋两大动物地理区的我国种 类最为丰富。櫝翅目昆虫较广泛地分布在多种类型的水域中，是重要的水质监测指标生物， 加强该类群的分类研宄，可以更好地为水质环境监测提供服务。
[0003] 从系统学和进化学的角度来看，櫝翅目是一个关键的类群。虽然櫝翅目系统发育 被广泛研宄，但仍需要通过其他更多的特征来证明。而通过分子手段获得的资料将更有助 于推断櫝翅目各科间的亲缘关系以及和其他目的亲缘关系。我国有关櫝翅目原颚类昆虫的 研宄仅限于传统形态学，分子学研宄目前仍是空白。深入了解櫝翅目昆虫的起源、进化和系 统发育关系，对重建櫝翅目系统发育乃至研宄昆虫纲的进化关系都具有重要意义。这就需 要借助快速而准确的分子手段对櫝翅目昆虫进行相关领域的研宄。
[0004] 近年来，利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种普遍而且有效 的方法，其中线粒体COI基因由于具有较高的进化速率已成为区分物种和研宄物种进化关 系的一种理想基因。因此，利用COI基因对櫝翅目昆虫进行物种鉴定和系统发育分析是一 种较好的方法，目前，昆虫遗传研宄过程中，扩增昆虫线粒体COI基因一般是采用已报道的 通用引物，但由于其通用性较强，特异性较弱，在实际研宄过程中，扩增昆虫COI基因的同 时，也往往能扩增出昆虫体表及体内杂菌的COI基因片段且扩增片段长度较短。这将导致 某些昆虫，如对櫝翅目昆虫的系统发育研宄的作用不理想，琼脂糖凝胶电泳检测的条带往 往为双条带甚至多条带，测序峰图多为双峰。这给对櫝翅目昆虫进行大规模的系统发育进 化研宄分析带来了阻碍。目前国际上没有专门针对扩增櫝翅目昆虫COI基因的特异性引物 的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种櫝翅目昆虫线粒体COI基因扩增的特异性引物，它能满足 现有技术的上述需求。
[0006] -对用于櫝翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增的引物，其序列如SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2 所示。
[0007] 本发明还公开了一种櫝翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增方法，是采用上述的引 物，用50 μ I PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。
[0008] 所述的 50 μ I PCR体系是：5 μ I 10Xbuffer(+Mg2+)，2· 5 μ I dNTP(2. 5mM)，3 μ 1 引物 LeC0I-F(10yM)，3yl 引物 LeC0I-R(10yM)，0.5yl rTaq 酶（5μ/μ1)，2μ1 DNA 模 板（IOOng)，34 μ 1 双蒸水。
[0009] 所述的PCR扩增条件是：94°C预变性5分钟，94°C变性1分钟15秒，51°C退火温度 1分钟15秒，72°C延伸1分钟5秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。
[0010] 本发明根据櫝翅目COI基因序列较保守和非特异性扩增引物扩增效率低的特性， 通过比对櫝翅目不同科物种的COI基因序列设计出扩增引物。采用本发明的櫝翅目线粒体 COI基因的扩增引物，可以有效地扩增出櫝翅目不同科物种的COI基因序列，填补了櫝翅目 COI基因没有专门的扩增引物的空白，对櫝翅目不同科和属的昆虫进行大规模的COI测序， 准确鉴定某些形态上难于鉴别的近缘物种，为我国櫝翅目昆虫的分类鉴定、系统发育、种群 遗传结构和地理种群鉴别提供了重要工具。本发明涉及的扩增引物较过去通用引物有较大 的优势，具体表现为：本引物能有效扩增出近2000bp的COI基因片段，完全覆盖COI基因全 长，而过去通用引物有效扩增长度一般为500-800bp，且扩增片段大多为保守区域，不利于 上述研宄的数据分析。利用本引物对櫝翅目昆虫进行大规模的系统发育进化分析，能显著 降低实验成本，缩短实验周期，提高实验的准确性。
【附图说明】
[0011] 图1是本发明引物对櫝翅目9科昆虫COI基因的扩增效果图。1为卷櫝；2为钮 櫝；3为扣櫝；4为钩櫝；5为襟櫝；6为新櫝；7为刺櫝；8为网櫝；9为绿櫝。
[0012] 图2是通用引物对櫝翅目9科昆虫COI基因扩增效果图。1为卷櫝；2为钮櫝；3 为扣櫝；4为钩櫝；5为襟櫝；6为新櫝；7为刺櫝；8为网櫝；9为绿櫝。
【具体实施方式】
[0013] 本发明的櫝翅目COI基因的扩增引物筛选方法共分两个步骤：1.以已经测得的櫝 翅目昆虫的线粒体基因组序列中COI基因的序列为基础，通过比对找出COI基因两端相对 保守的序列片段，不依赖已有的昆虫通用引物，设计櫝翅目专用引物；2.将合成的引物对 櫝翅目昆虫COI基因进行扩增，检测其在櫝翅目中的通用性和扩增效率；3.在过程中曾设 计出多对引物，经实验结果验证表明本发明的引物最优
[0014] 下面结合实例对发明做进一步说明：
[0015] 1.样品准备：样品均使用存放于扬州大学应用昆虫研宄所标本室内存放于100% 酒精的櫝翅目不同科的昆虫，包括绿櫝科、钩櫝科、扁櫝科、叉櫝科等科的櫝翅目昆虫。
[0016] 2. DNA提取：Axygen试剂盒提取DNA，具体步骤参照说明书。
[0017] 3.数据来源：数据来源于美国国立生物技术信息中心（NCBI, http:/www. ncbi. nlm. gov/) 〇
[0018] 4.序列比对：利用ClustalX软件将櫝翅目昆虫的线粒体基因组全序列中COI基 因两端的序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。
[0019] 5.弓丨物合成：根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primer Premier 5在碱基 变异度最小的序列片段设计出1对引物。引物序列为LeC0I-F:5' AAACTAATAGCCTTCAAAG 3'（SEQ ID NO. I) ;LeC0I-R:5'TATWTGGAGCTTAAATCCAT 3'（SEQ ID N0.2)。为了验证本发 明引物的特异性，我们同时使用了过去mtDNA COI的通用引物作为对照。其具体序列为： forward :5' -CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3'（SEQ ID NO. 3) ;reword :5' -TCCATGCACTAATCT GCCATATTA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0020] 6.引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR扩增所采集的样本。设置 TouchdownPCR热循环退火温度范围为40-60 °C。
[0021] 7.扩增结果检测：扩增引物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，该引物 可以有效地扩增櫝翅目昆虫的线粒体COI基因，扩增效率达100%。利用此对引物扩增出 的DNA片段长度约为2000bp，覆盖櫝翅目昆虫线粒体COI基因的全长（全长为1500bp左 右），且琼脂糖凝胶电泳检测条带较为单一（图1)。相反，通用引物扩增出的DNA片段长度 约为1000 bp(图2)，小于本发明引物的扩增长度，而且，琼脂糖凝胶电泳检测条带较差（图 2)。很明显，该通用引物不适合用于部分櫝翅目昆虫COI基因的扩增，且结果不准确。而本 发明引物可以有效地扩增出櫝翅目不同科物种的COI基因序列，且测序结果较准确。
[0022] 8.引物扩增条件：上述引物 50μ1 PCR 体系为：5μ1 10Xbuffer(+Mg2+)，2.5yl (1阶？(2.51111)，3 4 1引物1^0)1-卩(1(^]\〇,3 4 1引物1^0)1-1?(1(^]\〇,0.5 4 11^&9酶（5 4/ μ 1)，2 μ I DNA 模板（IOOng)，34 μ 1 双蒸水。
【主权项】
1. 一对用于櫝翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 所示。2. -种櫝翅目昆虫线粒体COI基因序列扩增方法，其特征是采用权利要求1所述的的 引物，用50 y I PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的50 y I PCR体系是：5 y 1含Mg2+的 10Xbuffer，2.5yl 2.5mM 的 dNTP，3yl IOyM 的上游引物，3yl IOyM 的下游引物， 〇? 5 y I 5 y / y 1 的 rTaq 酶，2 y I IOOng 的 DNA 模板，34 y 1 双蒸水。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的特定的PCR扩增条件是：94°C预变性5 分钟，94°C变性1分钟15秒，51°C退火温度1分钟15秒，72°C延伸1分钟5秒，共35个循 环，最后72 °C延伸10分钟。
【专利摘要】本发明涉及一种用于扩增襀翅目昆虫线粒体细胞色素c氧化酶I(cytochrome c oxidase I，COI)基因序列的引物，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。采用本发明的扩增引物，可以有效地扩增出多种襀翅目物种的COI基因，有助于准确鉴定某些形态上难于鉴别的近缘物种，为我国襀翅目昆虫的分类鉴定、系统发育、种群遗传结构和地理种群鉴别提供了重要工具。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/53
【公开号】CN104946645
【申请号】CN201510443567
【发明人】杜予州, 陈志腾, 陆明星
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月24日