一种水稻花药特异表达启动子OsAnth1的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 花药特异表达启动子OsAnthl及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标 基因在水稻花药中特异表达。
【背景技术】
[0002] 外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类 型的选择决定基因的表达时间和部位。植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种 顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基 因5'端上游区域调控基因转录的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确 地结合，确保转录精确而有效地起始，在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不 同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子。组成型启动子能在所有细胞或组织中， 不分时间和空间地启动转录。
[0003] 目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型启动子，比如CaMV35S启 动子和玉米Ubiquitin-I启动子，然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以 期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间（发育阶段特异性）或空间（组织 器官特异性）不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基 因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能 基因来改良作物品质时遇到的障碍。
[0004] 特异性启动子可以在特定的条件、部位或者时段集中表达。特异性启动子又可分 为组织特异型启动子和诱导型启动子，其中诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很 低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。
[0005] 随着转基因农作物在全球的大面积推广，启动子在转基因中的重要性得到广泛的 共识。水稻花药是水稻雄性配子花粉产生的器官，与水稻穗的发育、育种及水稻的产量等密 切相关。因此在水稻组织特异启动子的研宄领域中，花药特异性启动子是人们最为关注的 启动子之一。
[0006] 但是目前人们所发现的花药特异性启动子的遗传资源并不是十分丰富，限制了人 们对花药性状改良能力的提升。
[0007] 因此，本发明希望分离到一种水稻花药特异性表达的启动子，以用于驱动在花药 中特异性表达一些功能基因或结构基因，达到品种改良的目的。
【发明内容】
[0008] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻花药中特异性表达 的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。
[0009] 具体而言，本发明提供一种花药特异性强表达启动子，所述水稻花药强表达启动 子包含：
[0010] 1)序列表中SEQID NO: 1所示的DNA分子；或者
[0011] 2)在严格条件下与SEQID NO: 1中的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子； 或者
[0012] 3)与1)或2)中所限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的 DNA分子。
[0013] 优选地，本发明提供的水稻花药特异性强表达启动子由SEQ ID No: 1所示的序列 构成。
[0014] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的花药特异性强表达启动子，本文中称为OsAnthl或启动子OsAnthl。具体 而言，本申请的发明人发现日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基因上游包括转 录起始位点在内的1753bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻花药中特异性表达的功能， 并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
[0015] 另一方面，本发明还提供一组扩增权利要求1或2所述的水稻花药特异性强表达 启动子的全部或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物， 所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所述，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
[0016] 另一方面，本发明还提供含有权利要求1所述水稻花药特异性强表达启动子的 重组载体或表达盒，在所述重组载体或表达盒中，权利要求1所述的水稻花药特异性强表 达启动子连接于待表达基因的上游，所述待表达基因包括具有改变水稻花药性状能力的基 因。
[0017] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水稻 花药特异性强表达启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻花药特异性强表达启动子连 接于待表达的基因序列的上游。在一种实现方式中，所述待表达的基因为Gus基因。该重组 表达载体为将SEQ ID No: 1所示的序列即OsAnthl或启动子OsAnthl构建于pCAMBIA1391 中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-〇sAnthl。或者待表达基因可以为任何对 水稻花药具有改善功能的基因。
[0018] 另一方面，本发明还提供一种利用该启动子获得宿主菌的方法。所述宿主菌为将 本发明提供的上述水稻花药特异性强表达启动子、上述表达盒、或上述重组表达载体转入 根癌农杆菌而获得。
[0019] 另一方面，本发明提供一种利用该启动子获得转化子的方法。所述转化子为将本 发明提供的上述水稻花药特异性强表达启动子、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿 主菌转入转基因细胞系、愈伤组织或植株而获得。
[0020] 再一方面，本发明提供上述水稻花药特异性强表达启动子在培育转基因植物中的 应用。所述应用包括将本发明提供的上述水稻花药特异性强表达启动子连接于载体的待 表达的基因序列上游（例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载 体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0021] 并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，尤其是水稻的花药生长特性。 所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0022] 需要说明的是，本发明所提供的启动子序列中，序列开头的 "AAAATCCACCCATTGCCTCCAG"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp ; 序列末尾的序列" TCCTCCTCCGTCGTTCGCGTGC"为获得启动子过程中使用的反向引物的留存 序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp ;该DNA序列中剩余的部分则为 获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个 DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术 人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0023] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare) OsAnthl基因上游包括转录起始位点在内的1753bp的DNA序列，并将其命 名为启动子OsAnthl。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相 应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农 杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组 织化学染色检测发现，转基因植株的花药部位Gus基因显著表达，而其他部位如根茎叶等 中均没有明显的GUS活性，从而证明该1753bp的序列具有驱动基因在花药部位特异性表达 的活性。
[0024] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水 稻的花药部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，避免不必要部位表达带 来的物质能量浪费，有效改良水稻的特性。
[0025] 技术效果
[0026] 本发明所克隆的水稻启动子OsAnthl能够调控基因在水稻花药中特异性集中表 达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造改善植物花药 的生长特性，如通过该启动子驱动目标基因在植株中表达，例如，可以增强花药发育过程中 对环境的抵抗力，比如耐寒性、耐热性等等，从而培育出理想的转基因植物品种。
【附图说明】
[0027] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0028] 图1为将OsAnthl启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A 为PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-〇sAnthl示意图，其中示出了利用OsAnthl 启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0029] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0030] 图3为12周苗龄的OsAnthl::⑶S转基因植株组织染色图（标尺=5mm)。
【具体实施方式】
[0031] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0032] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施