植物雌蕊特异表达启动子OsPis1及其衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 雌蕊特异表达启动子OsPisl及其衍生物，该启动子能够在水稻转基因调控体系中特异性 的驱动目标基因的表达。
【背景技术】
[0002] 高等植物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。启 动子作为转录水平上一个重要的调控元件，通过和众多转录因子的结合进而决定了基因的 表达模式和表达强度。用组织特异表达启动子来驱动目的基因表达可有效地避免用组成型 启动子所带来的一些诸如代谢负担之类的负面效应。因此，如何让外源基因在植物体内定 向、高效、稳定的表达是植物基因工程研宄的出发点和落脚点，深入研宄启动子的结构、功 能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重要意义。
[0003] 由于植物的果实和种子是人类食物的主要来源，它们都是植物生殖器官发育的产 物，而植物生殖发育的关键是花的形成，因此，对植物生殖器官尤其花的发育分子遗传的研 宄显得尤为重要。高等植物发育形成花器官的过程需要许多基因的协同表达。
[0004] 水稻是非常重要的粮食作物之一，亦是功能基因组学研宄的模式植物。水稻作为 模式单子叶植物，是单子叶植物生殖器官发育研宄的主要对象。尽管目前水稻等单子叶植 物中均已经分离了多个决定花器官分化与发育的MADS-box基因和非MADS-box基因，但与 双子叶植物相比，目前水稻等单子叶植物生殖器官即花发育分子遗传基础研宄相对落后。 因此，开展水稻等单子叶植物生殖器官特异表达启动子的遗传研宄十分必要。
[0005] 但是，目前人们对于生殖器官特异表达启动子的研宄还不够深入，目前所开发出 的生殖器官特异表达启动子种类非常有限，远远不能够满足科研人员在改良水稻品种过程 中对启动子的需求。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本研宄的目的就是从水稻中分离克隆生殖器官特异表达启动子， 用于在雌蕊中特异性表达的一些功能基因或结构基因，为转基因水稻育种服务，来达到品 种改良的目的，为长远的启动子改造和设计储备资源。而且，本发明希望获得一种分离鉴定 本底信号低、特异性高的新型启动子，这种启动子对作物基因工程将有着重要的意义。
[0007] -方面，本发明提供一种水稻雌蕊特异表达启动子OsPisl，其特征在于，所述水稻 雌蕊特异表达启动子OsPisl提取自水稻属植物。
[0008] 在一种优选实现方式中，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPisl包含：
[0009] 1)序列表中SEQ ID No :1所示的DNA序列；或者
[0010] 2)在严格条件下与含有1)中的DNA序列杂交后具有启动子功能的DNA序列；或 者
[0011] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有70%-75%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0012] 4)与1)或2)限定的DNA序列具有75%-80%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0013] 5)与1)或2)限定的DNA序列具有80%-85%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0014] 6)与1)或2)限定的DNA序列具有85%-90%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0015] 7)与1)或2)限定的DNA序列具有90%-95%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0016] 8)与1)或2)限定的DNA序列具有95%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0017] 9)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的具有 启动子功能的核苷酸序列；
[0018] 10)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中去除一个或多个核苷酸后所获得的具 有启动子功能的核苷酸序列；
[0019] 11)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的具 有启动子功能的核苷酸序列。
[0020] 在一种优选实现方式中，所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPiSl提取自日本晴水 稻。
[0021] 另一方面，本发明提供一种含有所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPiSl的重组表 达载体或表达盒。
[0022] 在一种优选实现方式中，所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入 所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPisl得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述水 稻雌蕊特异表达启动子OsPisl连接于载体中待表达的基因序列的上游
[0023] 在一种优选实现方式中，所述待表达基因为水稻雌蕊特异表达基因。
[0024] 另一方面，本发明提供一种获取用于转基因植物培育的宿主菌的方法，其特征在 于，所述方法包括将包含所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPis 1、所述的重组表达载体、或所 述的表达盒转入根癌农杆菌。
[0025] 另一方面，本发明提供一种获取用于转基因植物培育的转化子的方法，其特征在 于，所述方法包括将所述水稻雌蕊特异表达启动子OsPisl转入第一菌种中，利用转入了所 述水稻雌蕊特异表达启动子OsPisl的第一菌种和植物载体构建植物表达载体，再将所述 植物表达载体转入到作为受体菌的第二菌种中，并利用转化后的所述第二菌种获得转基因 植物细胞、组织或植株。
[0026] 另一方面，本发明提供一种所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPisl在培育转基 因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPisl 连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化 到水稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述待表达基因为水稻雌蕊特异表达基因。 [0027] 本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No: 1中相同）：
[0028]
[0031] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头的22bp " cagtgacaac gacgcagcag ag"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾的22bp "ac gaacgacaac atgagcacca"为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列 与反向引物的相应序列互补）；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序 列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述 引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用 其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0032] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare) OsPisl基因上游包括转录起始位点在内的1890bp的DNA序列，并将其命名 为启动子OsPisl。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应 的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆 菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus表达 定量检测发现，转基因植株的雌蕊部位Gus基因表达水平提高，从而证明该1890bp的序列 具有驱动基因在雌蕊部位特异性表达的活性。
[0033] 本发明所述的水稻雌蕊特异表达启动子OsPisl与所需的靶标基因连接，构建重 组植物表达载体，经转化后，在水稻的雌蕊部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因 的效果，改良水稻的特性。因此，本发明的启动子可以替代组成型启动子。
[0034] 技术效果
[0035] 本发明所克隆的水稻启动子OsPisl能够调控基因在水稻雌蕊中特异性集中表 达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动 子驱动目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的特性，从而培育出理想的转基因植 物品种。
【附图说明】
[0036] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0037] 图1为将OsPisl启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A 为PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-〇sPisl示意图，其中示出了利用OsPisl 启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0038] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0039] 图3为12周苗龄的OsPisl::⑶S转基因植株组织染色图。在根、茎、叶、鞘组织中 均没有观察到代表GUS活性的蓝色，而在花中，仅在雌蕊中有蓝色出现，而颖壳、雄蕊中也 都没有表现出⑶S活性（标尺=2. 5mm)。
【具体实施方式】
[0040] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0041] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0042] 含有酶切位点的OsPisl启动子的获得
[0043] 步骤1、引物的设计
[0044] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻OsPisl基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0045] 本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载