一种chrm3基因的小干扰rna序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种CHRM3基因的小干扰RNA序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 恶性黑素瘤（malignant melanoma)是一类起源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤， 该病恶性程度高，易转移，预后差，目前使用的外科手术、放疗、化疗等治疗手段效果不佳。 选择特异有效的靶点，是治疗该病的关键。
[0003] 毒蕈喊型胆喊受体（muscarinic acetylcholine receptor，mAChR)属于 G 蛋白偶 联受体家族，是由460-590个氨基酸组成的7次跨膜糖蛋白，分子量为51-66kD。目前已经 克隆出五种mAChR亚型（即M1-M5)。其中CHRM3基因是M3型mAChR的编码基因，虽然发现 M3型mAChR在黑素瘤中有异常表达，但是由于缺少能作为特异性拮抗剂和或激动剂的化合 物，该受体在黑素瘤增殖、侵袭转移等生物学过程中的作用和机制尚不明确。
[0004] RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的一种生物学现象， 能特异干扰靶基因的表达。其作用机制是：核糖核酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结 合，将其剪切成21-23nt及3'端突出的小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)，随后 siRNA与RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链， 活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切 断，引发靶mRNA的特异性分解，从而抑制相应基因表达。RNA干扰技术为病毒感染性疾病、 遗传性疾病、肿瘤等特异性治疗带来希望，是当前世界各国竞争的重要领域。曾有相关专利 (例如 US2011065778A1，US8076472B2，US2010099750A1 等）公开了 CHRM3 基因的 RNA 干扰 序列，但是相关序列针对的CHRM3基因编号为NM_000740. 1，序列包含1773个碱基。最近 CHRM3基因的更新编码为NM_000740. 2,序列包含2757个碱基。因此碱基的变化将直接影 响RNA干扰序列的设计、合成、甚至生物学功能评价。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于以最新的CHRM3基因序列为靶点，提供一种新的特异性抑制 CHRM3基因表达的小干扰RNA序列及其应用。本发明涉及的CHRM3基因小干扰RNA序列能 在基因转录后产生干扰作用，特异性降低M3型mAChR的蛋白表达，抑制黑素瘤增殖和侵袭， 将来可能用于黑素瘤的治疗。
[0006] 其具体技术方案为：
[0007] 一种CHRM3基因的小干扰RNA序列，由下述正义链和反义链组成：
[0008] 正义链：5' -CCUCGCCUUUGUUUCCAAATT-3'，如 SEQ ID NO :2 所示；
[0009] 反义链：5' -UUUGGAAACAAAGGCGAGGTT-3'，如 SEQID NO :3 所示。
[0010] 本发明所述CHRM3基因的小干扰RNA序列在抑制黑素瘤细胞增殖中的应用。
[0011] 本发明所述CHRM3基因的小干扰RNA序列在降低黑素瘤细胞侵袭能力中的应用。
[0012] 本发明的有益效果是：
[0013] 本发明获得的小干扰RNA序列未见于以往公开报道，能在CHRM3基因的转录后进 行干扰，从而特异性降低M3型mAChR蛋白表达，抑制黑素瘤增殖和侵袭，将来可能用于黑素 瘤的治疗。
【附图说明】
[0014] 图1是siRNA对黑素瘤细胞系M3型mAChR蛋白的下调作用。（图示为Western blot检测M3型mAChR蛋白表达量，依次为空白组，对照组和siRNA组；β-actin为内参。 提示该siRNA能显著降低M3型mAChR蛋白的表达。
[0015] 图2是MTT法检测siRNA对黑素瘤细胞增殖的影响。结果表明：siRNA能显著抑 制黑素瘤A2058细胞的增殖，24小时抑制率最高，达到48%。48小时以后，抑制率逐渐降低 至20%。提示该siRNA具有抗肿瘤增殖的作用。
[0016] 图3是transwell小室检测siRNA对细胞迀移的影响。A为迀移肿瘤细胞光镜下 的典型表现。B为统计学结果，与对照组相比，siRNA能显著抑制黑素瘤A2058细胞的迀移。 提示该siRNA具有抗肿瘤细胞侵袭的作用。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0018] 本发明所用方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明均购自 Invitrogen，干扰序列由上海吉玛制药技术有限公司合成。实施例中的实验方法按照常规 条件，参考分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）和试剂说明书中所述的条件。
[0019] 实施例一：靶向人CHRM3基因特异性干扰序列的获得
[0020] 根据NCBI公开的人CHRM3基因序列（Genbank :ΝΜ_000740· 2)设计siRNA序列，具 体设计参考美国 Invitrogen 公司网站（其网址 http ://rnaidesigner. invitrogen.com/ rnaiexpress/sort. do)提供的RNAi在线设计软件，经过比对筛选获得含19个碱基的革巴基 因序列：5'-CCTCGCCTTTGTTTCCAAA-3'（SEQID NO :1)，对应的siRNA干扰序列由上海吉玛制 药技术有限公司合成，具体如下：
[0021] 正义链：5' -CCUCGCCUUUGUUUCCAAATT-3'（SEQ ID NO :2)
[0022] 反义链：5' -UUUGGAAACAAAGGCGAGGTT-3'（SEQ ID NO :3)
[0023] 实施例二：肿瘤细胞培养及Western blot检测siRNA对M3型mAChR蛋白表达的 效果。
[0024] 1)黑素瘤细胞系A2058 (ATCC，美国）细胞在10% DMEM中接种I X IO5个细胞，培 养条件为95%空气、5% C02、95%湿度、37°C恒温，常规换液。
[0025] 2) siRNA转染。实验分为空白组（不含转染试剂的正常细胞培养液）、对照组（阴 性对照购买自Santa Cruz，sc-37007)、siRNA组（合成的小干扰RNA序列）。以0. 125% 胰蛋白酶消化对数生长期的黑素瘤细胞系A2058制成单细胞悬液（细胞数IX IO5)， 接种于6孔板，培养至细胞融合度大于40 %。用250 μ 1无血清培养液（Opti-MEM)稀 释siRNA(转染细胞的终浓度为33ηΜ)，轻轻吹吸混匀。用250 μ I Opti-MEM稀释5 μ 1 LipofectamineTM2000,轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置10min。混合转染试剂和siRNA稀 释液，轻轻吹吸混匀，室温下静置20min。500 μ 1转染复合物与I. 5ml无血清DMEM混合后 加入到24孔细胞板（100 μ 1/孔），轻摇细胞板混合均匀。置于37°C、5 % C02培养箱。转 染24h后换培养液，按常规条件继续培养。
[0026] 3)Western blot检测M3型mAChR蛋白表达。A2058细胞转染24h后，吸去培养 基，PBS清洗细胞1-2次，向细胞中加100 μ IRIPA裂解液，收集细胞至I. 5ml管中，冰上静置 30min，离心12000rpm，30min取上清，制备成蛋白样品供分析。将制备的蛋白加入上样缓冲 液RSB)，用100°C煮沸5min后，立即移入冰上冷却，作为电泳的上样样品。用5%浓缩胶和 12 %分离胶电泳分离，上样量为20 μ g/泳道，电泳电压，浓缩胶为70V，分离胶为100V，电泳 时间约2. 5h。内参为β -actin。
[0027] 实施例三、MTT法检测检测siRNA对细胞增殖的影响
[0028] 1)以0. 125 %胰蛋白酶消化A2058细胞成单细胞悬液，分于96孔板，每孔100 μ 1。 37°C、5 % CO2培养箱中培养24h后，弃上清，每孔加入200 μ 1无血清培养基，转染4h (如前 所述实验分为空白组、对照组、siRNA组）。
[0029] 2)培养24h后弃上清，加入200 μ 110%胎牛血清培养液，分别培养24h、48h、72h 后，再加入20 μ I MTT溶液（5mg/ml)，并继续培养4h。
[0030] 3)弃上清，每孔加入150 μ 1二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分 溶解。在酶标仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0031 ] 4)计算细胞生长抑制率％ = [1_A(实验组)/A(对照组)]X 100%
[0032] 实施例四、迀移小室检测siRNA对细胞迀移的影响
[0033] 1)前处理。以0. 125%胰蛋白酶消化A2058细胞成单细胞悬液，种植于迀移小室。 37°C、5% CO2培养箱中培养24h后，弃上清。转染24h后，换成正常培养液待用。
[0034] 2)准备细胞悬液和小室。无菌条件下将迀移板拿出室温下放置lOmin，下室中 加入500 μ 1的10% FBS培养基；在上室先加入200 μ 1预温的低血清培养液，室温下静置 lOmin，水化。用含有0. 5% FBS低血清培养液重悬各组Α2058细胞，调整浓度IX IO5Cells/ mL。上室加150 μ 1细胞悬液，37°C孵育12h。
[0035] 3)染色和计数。棉签擦去上室上面的非迀移细胞，移去transwell小室，倒置，风 干，24孔板中加入0. 1 %结晶紫染液500 μ 1，将小室置于其中，使膜浸没在染液中，25min后 取出，PBS清洗3-5次。光镜下拍照，计数。
[0036] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种CHRM3基因的小干扰RNA序列及其应用，其特征在于，由下述正义链和反义链组 成： 正义链如SEQID NO : 2所示； 反义链如SEQ ID NO: 3所示。2. 权利要求1所述CHRM3基因的小干扰RNA序列在抑制黑素瘤细胞增殖中的应用。3. 权利要求1所述CHRM3基因的小干扰RNA序列在降低黑素瘤细胞侵袭能力中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种CHRM3基因的小干扰RNA序列及其应用，该siRNA序列正义链为SEQ ID NO：2，反义链为SEQ ID NO：3，该siRNA能有效降低M3型mAChR蛋白表达，抑制黑素瘤细胞的增殖和迁移能力，在抗肿瘤方面具有应用价值。
【IPC分类】A61P35/00, C12N15/113
【公开号】CN104946653
【申请号】CN201510411371
【发明人】于耀清, 王欢
【申请人】第四军医大学唐都医院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月3日