相同。
[0057] (2)细胞感染实验方法：将鸭原代成肌细胞以IXlO6细胞/孔接种于6孔板中，混 匀后37°C、5% CO2培养箱培养24h ;24h后更换为无抗生素的培养基，取慢病毒原液以MOI =10的比例加入慢病毒，同时加入终浓度为〇. 5 μ g/ml的聚凝胺（Polybrene)以促进慢病 毒感染。于37°C、5% CO2条件下培养6h，更换培养基，然后继续培养至96h。
[0058] (3)细胞感染的48h，采用荧光显微镜进行观察并拍照，同时采用明场观察总细胞 并拍照。如图1所示，各组细胞在48h的感染效率达70%左右。以上说明含有所设计合成 的三种shRNA及control-shRNA的慢病毒均能有效地感染鸭成肌细胞。
[0059] 实施例3
[0060] 重组慢病毒对鸭成肌细胞中MSTN基因表达的抑制作用：
[0061] 采用real-time PCR检测三种shRNA对鸭成肌细胞中MSTN基因表达水平的影响。
[0062] (1)实验分组：实验分为对照组（PLL3. 7-Control-shRNA)、 PLL-3.7-MSTN-shRNA-318 感染组、PLL-3.7-MSTN-shRNA-767 感染组、 PLL-3. 7-MSTN-shRNA-1096感染组，共4组，所有组的细胞数量及培养条件均相同。
[0063] (2)RNA提取及real-time PCR检测：细胞感染96h后，采用TrizolA+裂解细胞，并 采用氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总RNA，并将所提取的mRNA逆转录为cDNA，逆转录条 件为：37°C 60min。取各组细胞的cDNA作为模板，以β -actin作为内参，采用Real-time PCR检测MSTN的基因表达。所用MSTN与β -actin的引物序列如下：
[0064] MSTN Forward Primer :5'-GCACTGGTATTTGGCAGAGTATT-3'（SEQ ID NO. 9)
[0065] MSTN Reverse Primer :5'-TCACCTGGTCCTGGGAAAGT-3'（SEQ ID NO. 10)
[0066] β-actin Forward Primer :5'-TGAGAGTAGCCCCTGAGGAGCAC-3'（SEQ ID NO. 11)
[0067] β-actin Reverse Primer :5,-TAACACCATCACCAGACTCCATCAC-3,（SEQ ID NO. 12)
[0068] Real-time PCR 反应条件为：① 95°C 5min，变性；② 95°C 25s ;60°C 25s ;72°C 25s 40 个 cycle ;③ 95°C 25s ;60°C 25s ;72°C 25s 收集溶解曲线。
[0069] 如图2所示，三种shRNA序列均对鸭成肌细胞中MSTN的表达表现出抑制作用，分 别为 61. 6%，79. 1 %和 76. 9%。
[0070] 实施例4
[0071 ] PLL3. 7-MSTN-shRNA抑制MSTN的表达对鸭成肌细胞增殖的影响：
[0072] 采用酶标仪检测鸭成肌细胞不同时间的OD值，以衡量MSTN-shRNA抑制MSTN表达 后对鸭成肌细胞增殖的影响，具体方法如下：
[0073] 以2 X IO4/孔的细胞数接种于96孔板中，每组10个复孔，共铺6块板，置于37°C、 5% C02 培养箱中培养。24h 后分别将 PLL3. 7-MSTN-shRNA-138, PLL3. 7-MSTN-shRNA-767 和PLL3. 7-MSTN-shRNA-1096和PLL3. 7-Control-shRNA慢病毒感染每块板的鸭成肌细胞， 分别于感染后的1(1、2(1、3(1、4(1、5(1和6(1采用酶标仪对细胞数量进行检测，结果如图3所示。 从图中可以看出，与PLL3. 7-Control-shRNA组相比，PLL3. 7-MSTN-shRNA-138感染组细胞 数在感染后3d和4d显著增加；PLL3. 7-MSTN-shRNA-767感染组在感染后4d、5d和6d显著 增加；PLL3. 7-MSTN-shRNA-1096感染组在3d显著增加，4d和5d极显著增加。结果表明，三 种PLL3. 7-MSTN-shRNA慢病毒均能显著促进鸭成肌细胞的增殖。
[0074] 实施例5
[0075] PLL3. 7-MSTN-shRNA对鸭成肌细胞中生肌因子表达的影响：
[0076] 采用Real-time PCR的方法检测PLL3. 7-MSTN-shRNA抑制MSTN表达后对鸭成肌 细胞中生肌因子表达的影响，具体方法如下：
[0077] (1)实验分组：实验分为对照组（PLL3. 7-Control-shRNA)、 PLL-3.7-MSTN-shRNA-318 感染组、PLL-3.7-MSTN-shRNA-767 感染组、 PLL-3. 7-MSTN-shRNA-1096感染组，共4组，所有组的细胞数量均为I X IO6/孔，细胞接种于 6孔板中，每组设3个复孔，置于37°C、5% CO2培养箱中培养，于感染后96h收集细胞。
[0078] (2)RNA提取及real-time PCR检测：采用TrizolA+裂解收集的细胞，并采用 氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总RNA，将所提取mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件为： 37°C60min。取各组细胞的cDNA作为模板，以β-actin作为内参，采用Real-time PCR检 测MyoDl、Myf5、Myf6、MyoG四个生肌因子的表达情况。所用MyoDl、Myf5、Myf6、MyoG与 β -actin的引物序列如下：
[0079] MyoDl Forward Primer :5'-AAGGCGTGCAAGAGGAAGAC-3'（SEQ ID NO. 13)
[0080] MyoDl Reverse Primer :5,-TGGTTGGGGTTGGTGGA-3,（SEQ ID NO. 14)
[0081] Myf5-Forward Primer :5'-AGGAGGAGGCTGAAGAAAGTG-3'（SEQ ID NO. 15)
[0082] Myf5-Reverse Primer :5,-GCTCTGTCTCGGCAGGTGATA-3,（SEQ ID NO. 16)
[0083] MyfO-Forward Primer :5'-GGAGCGCCATCAGCTACATC-3'（SEQ ID NO. 17)
[0084] Myf6-Reverse Primer ：5'-CGAGGAAGTCCGAGCCAT T-3' (SEQ ID NO. 18)
[0085] MyoG-Forward Primer :5,-CGG ATCACCTCCTGCCTGA-3,（SEQ ID NO. 19)
[0086] MyoG-Reverse Primer :5'-CGTCCTCTACGGCGATGC T-3'（SEQ ID NO. 20)
[0087] β-actin Forward Primer :5'-TGAGAGTAGCCCCTGAGGAGCAC-3'（SEQ ID NO. 11)
[0088] β-actin Reverse Primer :5,-TAACACCATCACCAGACTCCATCAC-3,（SEQ ID NO. 12)
[0089] Real-time PCR 反应条件为：95°C 5min，变性；95°C 25s ;63°C 25s ;72°C 25s 40 个 cycle ;③ 95°C 25s ;63°C 25s ;72°C 25s 收集溶解曲线。
[0090] 结果如图4所示，与PLL3. 7-Control-shRNA组相比，在感染后96h， PLL-3. 7-MSTN-shRNA-318 感染组的 Myf5 显著增加；PPLL-3. 7-MSTN-shRNA-767 和 PLL-3. 7-MSTN-shRNA-1096感染组的MyoDl表达量均显著降低，Myf5的表达量均显著增加； 三组感染组中Myf6和MyoG的表达量变化均不显著。说明鸭成肌细胞中MSTN基因被抑制 后会影响MyoDl和Myf5的表达，对Myf6和MyoG的表达影响不显著。
[0091] 本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的 任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0092]
【主权项】
1. 一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列，其特征在于所述shRNA序列选自下列核苷 酸序列中的一种： (1) 如SEQ ID NO. 1-2所示的DNA序列； (2) 如SEQ ID NO. 3-4所示的DNA序列； (3) 如SEQ ID NO. 5-6所示的DNA序列。2. -种包含权利要求1所述的抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列的重组表达载体。3. 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是基于 PLL3. 7载体构建的载体。4. 一种权利要求2或3所述重组表达载体的应用，其特征在于，所述重组表达载体用于 促进鸭成肌细胞的增殖。5. -种权利要求1所述的抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列的应用，其特征在于，所 述shRNA序列用于促进鸭成肌细胞的增殖。
【专利摘要】本发明公开了一种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列及其应用，所述shRNA序列选自下列核苷酸序列中的一种：(1)如SEQ ID NO.1-2所示的DNA序列；(2)如SEQ ID NO.3-4所示的DNA序列；(3)如SEQ ID NO.5-6所示的DNA序列。所述shRNA序列用于促进鸭成肌细胞的增殖。本发明首次报道了抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列。上述三种抑制鸭MSTN基因表达的shRNA序列均可明显抑制鸭成肌细胞中MSTN基因在mRNA水平的表达，并且，通过抑制鸭成肌细胞中MSTN的表达促进了鸭成肌细胞的增殖，上调生肌调节因子Myf5基因的表达，下调生肌调节因子MyoD1基因的表达。本发明的鸭MSTN基因的三种shRNA序列均能有效抑制鸭成肌细胞中MSTN基因的表达，在基因水平的抑制效率分别达到了61.6％、79.1％和76.9％。
【IPC分类】C12N5/10, C12N15/63, C12N15/113
【公开号】CN104946654
【申请号】CN201510414216
【发明人】李慧芳, 朱春红, 陶志云, 姬改革, 徐文娟, 单艳菊, 束婧婷, 宋卫涛, 刘宏祥, 宋迟
【申请人】江苏省家禽科学研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月14日