一种人源碱性成纤维细胞生长因子、烟草叶绿体表达载体及生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人源碱性成纤维细胞生长因子，本 发明还涉及一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载体，本发明还 涉及一种携带扩增上述的载体的宿主细胞，本发明还涉及一种利用烟草叶绿体作为生物反 应器生产人源碱性成纤维细胞生长因子的方法。
【背景技术】
[0002] 喊性成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)是 FGFs 家 族中的一员，最初是由牛脑垂体和脑组织提取物中分离得到的一个肝素结合多肽，其等电 点为9. 6,因为能促进成纤维细胞的分裂增殖而得名。bFGF广泛分布于中胚层和神经外胚 层来源的多种组织和器官，也存在于肿瘤组织中，它具有促进细胞增殖、分化、迀移等多种 生物学效应，并参与血管重塑、骨骼形成、神经发育、肿瘤代谢等生理和病理过程。
[0003] bFGF作为内源性微量活性物质，在动物组织中含量极微，因此要作为一种产品广 泛应用于临床，仅依靠传统的组织提取方法是远远不够的，有必要应用基因工程手段生产。 自1986年Abraham等首次克隆了 bFGF的cDNA以来，bFGF基因的克隆和表达研宄取得了 重大的进展，在体内和体外均表现出广泛的生物学活性。实验证明，人工重组的bFGF和天 然的bFGF有着同样的生物功能。最近几年随着生物工程技术的发展，已能大批量生产重组 人bFGF，并在临床上用于治疗某些疾病，诸如：退行性神经系统疾病、脑缺血疾病、冠心病、 烧创伤等。
[0004] 由于叶绿体表达系统具有高效表达外源基因的特点，且其测算的生产成本较传统 的微生物发酵工艺更低廉，因而成为理想的生物反应器平台。此外，叶绿体基因工程生产的 大多数蛋白质可完成二硫键交联、正确折叠等转录后修饰，具有正确的空间构象和生物活 性，为商业化生产医用蛋白奠定了理论基础。Staub等将人源的生长素基因导入烟草叶绿 体基因组中，转基因烟草表达出的人源生长素比核表达系统高300倍，而且具有正常的生 物学活性。2004年，Daniell等将胰岛素生长因子IGF21基因转入烟草叶绿体中，得到成熟 的IGF21，表达量占可溶蛋白的32%，更重要的是，在叶绿体中表达的IGF21可以形成正确 的二硫键，而在大肠杆菌中则不能形成。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种人源碱性成纤维细胞生长因子基因，该基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶 绿体表达载体。
[0007] 本发明目的通过下述技术方案实现：一种用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子 的烟草叶绿体表达载体，该载体表达框两侧序列分别为克隆自烟草叶绿体基因组中的部分 16S核糖体RNA基因与异亮氨酸转移RNA基因构成的16S-trnI片段和丙氨酸转移RNA基因 与部分23S核糖体RNA基因构成的trnA-23S片段；在靠近trnA-23S片段的是上述的目的 基因 bFGF基因，其由叶绿体特异性融合启动子PrrnPclpPrbcL驱动，并由烟草叶绿体终止 子TpsbA终止的表达框；而靠近16S-trnI片段的分别是作为报告基因的绿色荧光蛋白基因 GFP和作为筛选标记基因的壮观霉素抗性基因 aadA，依次位于烟草叶绿体启动子Prrn与烟 草叶绿体终止子Trpsl6之间，构成多顺反子的表达框；命名为pWX-Nt03。
[0008] 本发明的第三目的是提供一种上述的载体的宿主细胞，该宿主细胞命名为Machl。
[0009] 本发明的第四目的是提供一种利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人源碱性成 纤维细胞生长因子的方法，解决了现有技术中存在的生产成本高、无法正确折叠、生物活性 低的问题。
[0010] 本发明目的通过下述技术方案实现：一种利用烟草叶绿体作为生物反应器生产人 源碱性成纤维细胞生长因子的方法，包括以下步骤：
[0011] 1)、构建烟草叶绿体表达载体pWX-Nt03 ;
[0012] 2)、bFGF基因的叶绿体转化及同质化筛选，得到烟草叶绿体转bFGF基因的同质化 植株；
[0013] 3)、叶绿体转基因烟草植株中bFGF表达量分析；
[0014] 4)、纯化重组人源碱性成纤维细胞生长因子，得到烟草叶绿体表达的碱性成纤维 细胞生长因子。
[0015] 在上述技术方案中，步骤1中构建烟草叶绿体表达载体pWX_Nt03具体为：
[0016] I. 1)、在保持氨基酸序列不发生改变的前提下，利用Gene Designer将编码基因的 所有密码子采用烟草叶绿体密码子最适编码方式进行密码子替换，对经修饰后的基因序列 再通过DNAMAN7. 0和VectorNTI 10. 0软件分析其中的酶切位点信息，将第35位氨基酸Ile 的编码密码子由第1最适密码子TAT，变更为第2最适密码子TAC以消除EcoR I酶切位点； 将第104位氨基酸Tyr的编码密码子由第1最适密码子TCT，变更为第2最适密码子TCA以 消除Psi I酶切位点；将第109位氨基酸Ser的编码密码子由第1最适密码子ATT，变更为 第2最适密码子ATA以消除Xba I和Bgl II酶切位点；优化后的人源碱性成纤维细胞生长 因子基因序列见SEQ ID NO. 1所不；
[0017] 1. 2)、构建烟草叶绿体表达载体pWX_Nt03,经密码子优化后的人源碱性成纤维细 胞生长因子基因 bFGF，由叶绿体特异性融合启动子PrrnPclpPrbcL驱动，并由烟草叶绿体 终止子TpsbA终止，构成目的基因表达框。作为报告基因的绿色荧光蛋白基因 GFP和作为 筛选标记基因的壮观霉素抗性基因 aadA依次位于烟草叶绿体启动子Prrn与烟草叶绿体 终止子Trpsie之间，构成筛选标记表达框；上述两个表达框化学合成后，通过酶切连接导 入来自烟草叶绿体基因组中的部分16S核糖体RNA基因与异亮氨酸转移RNA基因构成的 16S-trnI片段和丙氨酸转移RNA基因与部分23S核糖体RNA基因构成的trnA-23S片段 两段同源片段之间，最终获得用于生产人源碱性成纤维细胞生长因子的烟草叶绿体表达载 体，命名为pWX-Nt03。
[0018] 步骤2中bFGF基因的叶绿体转化及同质化筛选具体为：
[0019] 1)用ros 1000/He基因枪进行叶绿体转化：金粉颗粒直径为0. 6 μπι，轰击距离为 9cm，可裂膜采用IlOOpsi，金粉微弹按每毫克金粉用0. 2 μ g质粒DNA包裹；
[0020] 2)筛选：第一轮筛选：轰击过的叶片背面朝上在恢复养基上25°C暗培养3天；暗 培养后，将叶片切成5_X 5mm的小块，背面朝下放在筛选培养基I上，以16小时光照、8小 时黑暗的光周期25°C培养，每20天更新一次培养基。产生不定芽后，用365nm紫外灯检测， 将产生绿色荧光的不定芽剪下，置于生根培养基II上；PCR检测选择性标记基因 GFP、aadA 以及目的基因 bFGF，其中，培养基I具体为4.3g/L MS盐、30g/L蔗糖、2mg/L 6-BA、0. lmg/L NAA、500mg/L壮观霉素和8g/L琼脂，ρΗ5· 8 ;生根培养基II具体为：4. 3g/L MS盐、30g/L蔗 糖、500mg/L壮观霉素和8g/L琼脂，ρΗ5· 8。
[0021] 第二至多轮筛选：选取转基因植株中绿色荧光较强的植株，将其叶片切成 5mmX5mm的小块，背面朝下放在筛选培养基按照与第一轮相同条件重复筛选，期间通过在 PCR方式进行烟草转基因植株同质化进程的检测，重复此筛选过程直至获得同质化的不定 芽，将获得的