试剂盒及确定待测dna样本预定snp位点的基因型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及试剂盒及确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法。
【背景技术】
[0002] 据WHO统计，全球抑郁症发病率为11%。在我国抑郁症发病率约为3%~5%，目 前已经有超过2600万人患有抑郁症。药物是治疗抑郁症的最有效方法。在中国约10%的 患者接受了相关的药物治疗。美国人口中的10%在服用抗抑郁症药物，而其中45~55岁 妇女中服用抗抑郁症药物高达25%。然而，抗抑郁症药物在过去十年中为医药公司带来可 观利益同时，相关问题不容忽视：首先，抗抑郁症药物副作用大且存在显著的个体化差异， 服用第二代抗抑郁症药物的患者平均有61%经历至少一种副作用。最常见的有头痛、失眠 症和性功能障碍等；其次，用药剂量存在个体化的问题，用药量不当会导致死亡；再次，疗 效个体化差异大，仅30%~45%的患者获得临床症状的完全缓解。研究表明，人群对抗抑 郁症药物的个体差异与单核苷酸多态性（SNP)密切相关。国内外学者正在纷纷开展此类研 究，并证实了 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680位点与个体的抗抑郁症药物用药相关。因而，在抗抑郁症药物用药之前，需药个体的 上述SNP位点的基因型检测和分型，意义重大。
[0003] 然而，现阶段 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、 rs4986893和rs4680位点的检测和基因型分型的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0004] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0005] 目前检测SNP位点的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性 限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该 方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度 而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。荧光定量PCR和多重PCR方法尽管特异性有所提 高，但是这两种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，荧光信号的强弱，引物特异性以及 低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法虽然是目前进行基因诊断的 金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失 败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率熔解曲线法是 一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度控制的精密性，假阳性 高。Taqman探针杂交法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快 速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。Taqman探针杂 交法的原理为：在TaqMan探针法的PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针，探针只 与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间，探针的5'端标记有报告基因，如FAM、 VIC，3'端标记有荧光淬灭基团，如MGB TAMRA ;当探针完整的时候，报告基因所发射的荧光 能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号；随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与 模板结合的探针，其3' -5'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能 量不能被吸收，即产生荧光信号。由此，应用一对双荧光标记的Taqman探针，分别针对双 等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针才能够扩增出各自的基因型；用两种荧光信 号能够被显著区分的荧光染料分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个 SNP位点的基因型判定。因而，利用该方法进行SNP基因型分型时，引物和探针的设计至关 重要，引物长度、探针长度、引物特异性和探针特异性均会显著影响检测结果的特异性和敏 感性。
[0006] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个 目的在于提出一种能够有效用于 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、 rs4244285、rs4986893和rs4680位点检测的试剂盒，以及确定待测DNA样本的rs2032583、 rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680 位点的基因型的 方法。
[0007] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂 盒包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；第二核酸 分子，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；第一探针，所述第一探针具 有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列；第二探针，所述第二探针具有SEQ ID NO :4所示的核苷 酸序列；第三核酸分子，所述第三核酸分子具有SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；第四核酸 分子，所述第四核酸分子具有SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列；第三探针，所述第三探针具 有SEQ ID NO :7所示的核苷酸序列；第四探针，所述第四探针具有SEQ ID NO :8所示的核苷 酸序列；第五核酸分子，所述第五核酸分子具有SEQ ID NO :9所示的核苷酸序列；第六核酸 分子，所述第六核酸分子具有SEQ ID NO :10所示的核苷酸序列；第五探针，所述第五探针 具有SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列；第六探针，所述第六探针具有SEQ ID NO :12所示 的核苷酸序列；第七核酸分子，所述第七核酸分子具有SEQ ID NO :13所不的核苷酸序列； 第八核酸分子，所述第八核酸分子具有SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列；第七探针，所述 第七探针具有SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列；第八探针，所述第八探针具有SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列；第九核酸分子，所述第九核酸分子具有SEQ ID NO :17所示的核苷酸 序列；第十核酸分子，所述第十核酸分子具有SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列；第九探针， 所述第九探针具有SEQ ID NO :19所示的核苷酸序列；第十探针，所述第十探针具有SEQ ID NO :20所示的核苷酸序列；第十一核酸分子，所述第十一核酸分子具有SEQ ID NO :21所示 的核苷酸序列；第十二核酸分子，所述第十二核酸分子具有SEQ ID NO :22所示的核苷酸序 列；第十一探针，所述第十一探针具有SEQ ID NO :23所示的核苷酸序列；第十二探针，所述 第十二探针具有SEQ ID NO :24所示的核苷酸序列；第十三核酸分子，所述第十三核酸分 子具有SEQ ID NO :25所示的核苷酸序列；第十四核酸分子，所述第十四核酸分子具有SEQ ID NO :26所示的核苷酸序列；第十三探针，所述第十三探针具有SEQ ID NO :27所示的核苷 酸序列；第十四探针，所述第十四探针具有SEQ ID NO :28所示的核苷酸序列；第十五核酸 分子，所述第十五核酸分子具有SEQ ID NO :29所示的核苷酸序列；第十六核酸分子，所述 第十六核酸分子具有SEQ ID NO :30所示的核苷酸序列；第十五探针，所述第十五探针具有 SEQ ID NO :31所示的核苷酸序列；第十六探针，所述第十六探针具有SEQ ID NO :32所示 的核苷酸序列，其中，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所 述第一探针与所述第二探针的荧光报告基团不同，所述第三探针与所述第四探针的荧光报 告基团不同，所述第五探针与所述第六探针的荧光报告基团不同，所述第七探针与所述第 八探针的荧光报告基团不同，所述第九探针与所述第十探针的荧光报告基团不同，所述第 十一探针与所述第十二探针的荧光报告基团不同，所述第十三探针与所述第十四探针的荧 光报告基团不同，所述第十五探针与所述第十六探针的荧光报告基团不同。
[0008] 根据本发明的实施例，本发明的试剂盒能够用于rs2032583、rsl800532、rs6265、 rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680 位点的检测。具体地，根据 Taqman 探针杂交法，利用该试剂盒中的试剂，将待测DNA样本进行荧光定量PCR后，基于荧光定量 PCR 结果即可容易地确定 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、 rs4986893 和 rs4680 位点的基因型。进而，可以将 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、 rsl065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的基因型信息，与其他临床信息结合分 析，用于指导待测DNA样本来源的个体的抗抑郁症药物用药。
[0009] 根据本发明的实施例，所述荧光报告基团为FAM或VIC，所述淬灭基团为MGB。
[0010] 根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种确定待测DNA样本预定SNP位 点的基因型的方法，所述预定SNP位点为选自rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、 rsl065852、rs4244285、rs4986893和rs4680位点的至少一种。根据本发明的实施例，该方 法包括：根据Taqman探针杂交法，利用前面所述的试剂盒，将所述待测DNA样本进行荧光 定量PCR ;以及对荧光定量PCR结果进行分析，以便确定待测样本预定SNP位点的基因型， 其中，针对rs2032583位点，采用所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针和第二探针； 针对rsl800532位点，采用所述第三核酸分子、第四核酸分子、第三探针和第四探针；针对 rs6265位点，采用所述第五核酸分子、第六核酸分子、第五探针和第六探针；针对rs6311位 点，采用所述第七核酸分子、第八核酸分子、第七探针和第八探针；针对rsl065852位点，采 用所述第九核酸分子、第十核酸分子、第九探针和第十探针；针对rs4244285位点，采用所 述第i 核酸分子、第十二核酸分子、第i 探针和第十二探针；针对rs4986893位点，采 用所述第十三核酸分子、第十四核酸分子、第十三探针和第十四探针；针对rs4680位点，采 用所述第十五核酸分子、第十六核酸分子、第十五探针和第十六探针。。
[0011] 根据本发明的实施例，利用本发明的方法能够有效地确定待测DNA样本 rs2032583、rsl800532、rs6265、rs6311、rsl065852、rs4244285、rs4986893 和 rs4680 位点 的基因型。此外，发明人惊奇地发现，该方法成本低、特异性强、灵敏度高、准确度高、可重 复性好，且在一次PCR反应中即可完成对单个SNP位点的基因型判定，操作方便、快速。
[0012] 另外，根据本发明上述实施例的确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法 还可以具有如下附加的技术特征：
[0013] 根据本发明的实施例，利用ABI Stepone荧光定量PCR仪进行所述荧光定量PCR。 由此，荧光定量PCR结果准确，有利于后续的分析，进而有利于预定SNP位点基因型的确定。
[0014] 根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR的反应体系为：5重量份的Taqman Genotyping Master Mix ;3. 5重量份的超纯水；0. 5重量份的组合物；以及1重量份的待测 DNA样本，其中，针对rs2032583位点，所述组合物由所述第一核酸分子、第二核酸分子、第 一探针和第二探针组成；针对rsl800532位点，所述组合物由所述第三核酸分子、第四核酸 分子、第三探针和第四探针组成；针对rs6265位点，所述组合物由所述第五核酸分子、第六 核酸分子、第五探针和第六探针组成；针对rs6311位点，所述组合物由所述第七核酸分子、 第八核酸分子、第七探针和第八探针组成；针对rsl065852位点，所述组合物由所述第九核 酸分子、第