检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒的制作方法

文档序号:9231164阅读:655来源:国知局
检测牛LF基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域,具体涉及检测牛LF基因 mRNA表达水平的特异性 引物和荧光定量PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是DNA体外操作技术中最 常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异性引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放 在同一个缓冲反应体系中,进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环,实现靶DNA 片段在反应液中呈2n倍扩增(其中η为热循环次数)。
[0003] 荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上,结合了实时荧光检测技术和计算 机分析技术。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质,通过检测每 个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况,并获得每个 样本的荧光定量变化曲线,进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数); 同时,在相同的反应体系和反应条件下检测2 (或10)倍稀释的已知数量的靶标DNA,获得 其Ct值,以起始模板数的对数为横坐标,以Ct值为纵坐标制备标准曲线,据此标准曲线和 各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
[0004] 虽然Northern blot技术可检测基因的mRNA表达水平,但整个实验过程操作比较 复杂。Northern blot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解,所以Northern Blot中 所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程,如高温烘烤、DEPC处理等。另外,Northern Blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验 虽然降低了实验人员的工作量,并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化,但 是其灵敏度较低。
[0005] 而SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后,其 荧光大大增强。该性质用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为 497 nm,发射波长最大约为520 nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧 光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发 射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
[0006] SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点,由于它与所有的双链DNA相结 合,不必因为模板不同而特别定制,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低。此外,由于 一个PCR产物可以与多分子的染料结合,因此SRYB Green的灵敏度很高。但是,由于SYRB Green与所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引 起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产 物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果。
[0007] 乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是在分离乳清蛋白时得到的一种重要的非血红素铁 结合糖蛋白,是中性粒细胞颗粒中具有杀菌活性的单体糖蛋白,主要由乳腺上皮细胞表达 和分泌。LF蛋白具有广谱抗菌能力的单体糖蛋白,在初乳中的含量是常乳的十几倍甚至几 十倍,对幼畜初期免疫具有重要作用。LF蛋白不仅参与铁的转运,而且具有广谱抗菌、抗病 毒、抗氧化、抑杀肿瘤细胞、调节免疫系统等强大生物功能,不易产生耐药性,对动物的细胞 几乎没有毒性,并且不含稀有氨基酸和外源化学成分,被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和 极具开发潜力的食品和饲料添加剂。在干乳期和患有乳房炎的时期,牛的乳腺中LF蛋白表 达量会显著升高,这主要是为了对抗乳腺组织中的病原微生物和炎症反应。因此,通过对LF 基因表达量的检测,可以监测牛在患病过程中免疫能力的变化。

【发明内容】

[0008] 本发明提供了检测乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)基因 mRNA表达水平的特异性引物 和荧光定量PCR检测试剂盒。通过大量的实验研宄,我们优化出了一套能够有效检测不同 牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)LF基因 mRNA表达量的引物和PCR反应的条件,并组装成LF 基因 mRNA表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒,以满足生命科学、动物医学和动物科 学研宄者的检测需要。
[0009] 本发明提供一种检测牛LF基因 mRNA表达水平的特异性引物,所述特异性引物的 核苷酸序列为: 上游引物序列为:5' -CCCGCTACTTGACCACCTT-3' ; 下游引物序列为:5' -TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3'。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种牛LF基因 mRNA表达水平的荧光定量PCR检测试 剂盒,所述试剂盒包括特异性引物,所述特异性引物序列为: 上游引物序列为:5' -CCCGCTACTTGACCACCTT-3' ; 下游引物序列为:5' -TCCACTGCTGGCACTTCTTC-3'。
[0011] 优选地,所述试剂盒还包括SYBR Green染料。
[0012] 优选地,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0013] 优选地,所述阳性对照的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No. 3。
[0014] 本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法,是以待测cDNA为模板,利用 权利要求1所述的特异性引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR,记录Ct值,并以 LF标准基因作为阳性对照绘制标准曲线,据此标准曲线和Ct值进行定量测定。
[0015] 优选地,所述实时荧光定量PCR的反应条件是:95°C预变性30秒;95°C 5秒, 57. 9°C 20秒,捕捉焚光信号,循环40次。
[0016] 本发明的第四个目的是提供一种牛LF基因 mRNA表达水平的定量检测方法,是以 待测cDNA为模板,利用权利要求1所述的特异性引物和SYBR Green染料进行实时荧光定 量PCR,记录Ct值,并以LF标准基因作为阳性对照绘制标准曲线,据此标准曲线和Ct值进 行定量测定。
[0017] 优选地,所述实时荧光定量PCR的反应条件是:95°C预变性30秒;95°C 5秒, 57. 9°C 20秒,捕捉焚光信号,循环40次。
[0018] 本发明的第五个目的是提供权利要求1所述的特异性引物、权利要求2-5任一所 述的试剂盒、序列表中SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列在定量检测牛LF基因 mRNA表达水 平中的应用;优选地,所述牛为黄牛、奶牛和牦牛。
[0019] 与现有技术相比,本发明的优点在于: 1.本发明实现了简便快捷的定量检测LF基因 mRNA表达水平的目的,可以监测不同牛 种(包括奶牛、黄牛和牦牛)、不同组织、不同时期的LF基因的mRNA表达状态。
[0020] 2.本发明在检测基因 mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的 优点。
[0021] 3.本发明可以监测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)乳铁蛋白(Lactoferrin,LF) 基因 mRNA转录水平,通过对该基因的研宄,可以鉴定该基因与动物免疫能力的相关性。
【附图说明】
[0022] 附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实 施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中: 图1为LF基因 mRNA表达水平的荧光检测结果图。其中,A :扩增曲线,横坐标为PCR循 环次数,纵坐标为相对焚光量值(Relative Fluorescence Units,RFU);B:恪解曲线,横坐 标为温度,纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量(d (RFU) /dT )。
【具体实施方式】
[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0024] 其中,SYBR Green染料购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0025] 实施例1 本发明的LF基因 mRNA表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒由以下组分组成: 2XSYBR GREEN MIX 5mL ; 阳性对照:标准LF基因模板 500 μ L ; 引物混合液 500 yL; 超纯水 5mL。
[0026] 其中,2X SYBR GREEN MIX 由以下组分组成:Taq DNA 聚合酶 0· I U/μ UdNTPs 底 物 0· 4 mmol /1,、Mg2+ 5. 0 mmol/L、KCl 100
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