免疫抑制细胞及其制造和使用方法
【专利说明】免疫抑制细胞及其制造和使用方法
【相关申请】
[0001]本申请要求申请日为2012年6月4日的美国临时申请N0.61/655，191的优先权，该申请的全部内容以引用方式全部合并于此。
【先前技术】
[0002]髓源性抑制细胞(MDSCs)是一群包含有早期髓系前驱细胞/粒细胞异质群体、巨噬细胞和树突状细胞等异细胞亚群的集合体。这些细胞通常由髓系标记Gr-1和CDllb表现其特征。髓源性抑制细胞由于可藉由增加免疫抑制因子，例如精氨酸酶I(ARG-1)和一氧化氮合酶2(N0S2)之表现来抑制T细胞效应之功能，而在肿瘤免疫逃逸机制、自体免疫疾病、移植排斥反应，慢性炎症及感染等方面扮演重要角色。参见(例如)，Gabrilovich与Nagaraj, Nat Rev Tmmunol 9:162-174(2009)。
[0003]由于髓源性抑制细胞所具有之免疫抑制特性，而使其能做为治疗免疫性疾病的候选药物。因此，亟需一种藉由得自活体培养方式产生之稳定且安全的髓源性抑制细胞。
【
【发明内容】
】
[0004]本发明基于此发现，生长调节致癌基因(GRO)趋化激素，尤其是GRO-γ，对于人类周边血单核细胞衍生的树突状细胞(MDDCs)之分化及功能具有抑制作用。此外，发现GRO-y可驱动MDDCs分化成为一种类似髓源性抑制细胞(MDSC)的表现型。
[0005]因此，本发明所描述系关于一种获得免疫抑制细胞的方法。该方法包括:获得一种能分化成树突状细胞之前驱细胞；及将该前驱细胞培养于含有一趋化激素之培养基中一段足够使该前驱细胞分化为树突状细胞的时间，其中该树突状细胞系呈现一种免疫抑制表型，而藉此获得该免疫抑制细胞。所述之趋化激素可为一种GRO趋化激素，例如，GRO-γ或GRO- α。
[0006]另一方面，本发明包含一种藉由上述方法得到之免疫抑制细胞，及含有该细胞的组成物。
[0007]本发明亦描述一种使用上述细胞或细胞组成物治疗个体中各种病况之方法。例如，本发明之细胞或细胞组成物可用于有需要之个体中抑制免疫反应，调节与肿瘤发生相关之血管新生，治疗自身免疫疾病，治疗发炎性疾病，或治疗移植物对抗宿主疾病(GVHD)。
【图式简单说明】
[0008]图1表示间叶系干细胞(MSC)-条件培养基对于MDDC分化产生了抑制效果。将纯化来自人类PBMCS的⑶14+单核细胞培养在有或无MSC-条件培养基(MSC-CM) (1/2Χ体积)存在下培养于DC-分化培养基中。于第5天iDC再经无或以LPS(lmg/mL)处理(mDC)两天。于第7天分析MDDCs的表型和功能。㈧针对与DC成熟相关之表面标记进行染色，并以流式细胞仪分析，测定10，000个细胞的平均荧光强度(MFI)。(B)未成熟之MDDCs以荧光标记葡聚糖试剂(lmg/mL)于37°C下施予脉冲30分钟，并藉由以流式细胞仪测量之FITC-葡聚醣摄取量分析其内吞能力。所显示于FITC-葡聚醣摄入后之FACS图谱为:无FTIC-葡聚醣存在下的MDDCs作为阴性对照组(NC，灰线)，iMDDCs (iDC,虚线)，及有MSC-CM存在下之iMDDCs具(iDC+MSC-CM，黑色实线)。数据为于2位供者进行之三次独立实验的代表性结果。(C)成熟MDDCs与同种异体之T细胞共培养4天(DC:T = 1:10)，并于以I μ Ci/孔之[3H]-胸苷施予脉冲16小时后测量定与胸苷的并入量。藉由于三名供者各重复三次所测得之[3H]-胸苷并入量来测定T细胞增生。数据以相对于无MSC-CM补充组之倍数(MFI 土 SD)，或以[3H]-胸苷摄取量之CPM(平均值土SD)表示。数据代表三次独立实验之结果。(η =3 位供者，每次实验)ο *:ρ<0.05 ;林:p<0.01 ;***:ρ<0.0001ο
[0009]图2表示MSC-CM对MDDCs的抑制效果可藉由将抗-GRO- γ中和抗体加入MSC-CM而产生逆转。(A)使用市售之人类细胞激素/趋化激素抗体数组(RayB1)比较得自MSC条件培养基(MSC-CM)与含血清培养基对照组的细胞激素图谱。培养基中所含细胞激素和趋化激素的量，系藉由将所述之数组膜先与对抗特定细胞激素或趋化激素之生物素标记的抗体，之后再与HRP-共轭的卵白素进行培养，然后将其以X-射线底片曝光而测定得。实验重复2次。(B)以流式细胞仪分析GRO趋化激素及IL-8对于未成熟MDDCs上之⑶40之表现的影响。将人类⑶14+单核细胞于IL-4(80ng/mL)和GM-CSF(80ng/mL)存在下，在含有10%人类AB+血清之a-MEM培养基中进行分化。于第7天，将⑶14 +单核细胞、单独之未成熟MDDCs或补充以GRO- a、GRO- β、GRO- γ或IL-8之未成熟MDDCs进行针对CD40表现之染色，并以流式细胞仪分析。灰线对应未染色的对照组。所示数据为对应所指定趋化激素之⑶40阳性细胞的百分比。实验结果来自三个独立实验。(C)以抗-GRO-γ (10 μ g/mL)抗体或同种型匹配的对照抗体于37 °C下培养60分钟，将MSC-CM中的GRO- γ活性中和，之后放置于4°C下隔夜。将MDDCs在有或不含MSC-CM(1/2X体积)之DC分化培养基中，于有或无中和性抗-GRO-γ抗体存在下进行分化。利用流式细胞仪进行MDDCs表型分析，结果以平均荧光强度相对于未经处理之iDC(MFI土SD)所获得数值的倍数表示。结果来自两个实验，每组包括两名供者。*:ρ〈0.05 ;林:p<0.0lo
[0010]图3显示GRO- γ抑制MDDCs的分化。纯化自人类PBMCs之⑶14+单核细胞于有或无重组GRO-γ (250ng/mL)存在下，经过或未经CXCR2受体竞争型拮抗剂SB225002 (250nm)预处理30分钟的条件下进行分化。于第7天，分析MDDCs的表型和功能。(A)经过表面标记标定后，使用流式细胞仪进行MDDCs的表型分析。条形图代表相对于未经处理之iDCS所获得之MFI的MFI倍数(MFI ± SD之倍数)。数据相当于三个独立实验之平均值，其中每个实验包括两至三名供者。(B)在37°C下，将未成熟之MDDCs以FITC-葡聚醣(lmg/mL)施予脉冲30分钟，并以流式细胞仪测定其摄取情形。数据系来自五个不同实验，且以相对于iDC组之MFIiSD的倍数表示。η = 2-3。(C)将成熟MDDCs与同种异体T细胞(DC:T = 1:10)共培养4天，并于以I μ Ci/孔之[3H]-胸苷施予16小时-脉冲后胸苷与测定胸苷并入量。以[3H]-胸苷并入量来测定T细胞增生。数据以相对于未经处理之MMDCs之CPM(平均值土SD)的倍数表示，且数据系来自五个独立的实验。η = 2-3ο *:ρ<0.05:ρ<0.01 ;***:ρ〈0.0OOl0
[0011]图4显示于GRO-γ存在下分化的MDDCs具有细胞激素耐受性。将纯化自人类PBMCs之⑶14+单核细胞于有或无重组GRO-γ (250ng/mL)存在下，经过或未经CXCR2受体竞争型拮抗剂SB225002 (250nm)预处理30分钟的条件下进行分化。(A)以实时RT-PCR测定培养7天之MDDCs的mRNA表现。将Ct值以GAPDH基因之表现量为基准归一化。以2_Λ ct法计算差异值，且数据以相对于未经处理之DC所获得之值的百分比表示。结果代表得自五个独立的实验重复三次的平均值±标准偏差。*:p<0.05 ;林:p<0.01:ρ<0.0001ο (B)培养液中的细胞激素含量以ELISA进行测定。数据系以相对于未经处理DC所获得之值(平均值土SD)的细胞激素浓度倍数。η = 2-3ο数据来自至少三个独立的实验。*:ρ<0.05 ;林:p〈0.01 ;***:ρ〈0.0OOl0 (C)将进行分化5天之未成熟MDDCs固定于载玻片上，并以0.1 %(v/v)NP-40/PBS使其具有可通透性。藉由将MDDCs以小鼠抗-人类IDO抗体(1/50)，及之后之山羊抗-小鼠IgG-DyLight 488标记的抗体(1/150)进行染色，来检测细胞内的IDO表现。通过共聚焦显微镜采集影像。线段=10μπι。
[0012]图5显示受GRO- γ处理之MDDCs启动的T细胞具有耐受性性质。将人类⑶3+Τ细胞(3X 15个)以被3X 10 4个于有或无重组GRO-γ存在下，经过或未经SB225002预处理之条件下进行分化之MDDCs刺激。(A)以RT-PCR评估于纯化自MDDC的CD3+T细胞及T细胞共培养物中之选择性基因IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA表现。相对基因表现系对于GAPDH之表现正常化。数据以相对于经DC-启动之T细胞组所得值(平均值土SD)的基因表现倍数表示(η = 3)。实验结果来自5个独立实验。(B)以ELISA分析存在于收集自与T淋巴细胞共培养之经GRO- γ处理和未处理的MDDCs之细胞培养上清中的细胞激素图谱。数据以细胞因子浓度的平均值土标准偏差表示。η = 2-3。结果来自三个独立实验。*:ρ〈0.05:ρ〈0.01 ;***:ρ〈0.0001。
[0013]图6显示GRO-γ处理之BMDC呈现MDSC细胞之细胞图谱。(A)自C57BL/6小鼠采集骨髓细胞，并以单独GM-CSF、GM-CSF/GR0- γ或GM-CSF/GR0- γ /SB225002处理六天使其分化为BMDCs。以FACS分析使用抗⑶Ilb和GR-1抗体进行纯化自BMDCs表面标定。然后使用FACS Aria细胞分选仪分离⑶I Ib和GR-1双阳性细胞，并以RT-PCR测定精氨酸酶I和诱导型一氧化氮合酶基因的转录程度。mRNA的表现系以BMDCs相对mRNA倍数表现(对GAPDH基因表现量正常化)。数据取自三次测量平均值土标准偏差(η = 3)。结果来自三次独立实验。(B)以FACS Aria分选出OT-1/⑶8+Τ细胞，并于0VA257-264胜肽存在下与经GRO- γ处理或未经处理的BMDC共培养3天。使用3H-胸苷并入分析来测定抗原特定刺激之T细胞增生。(C)为于活体内分析GRO-处理细胞之免疫抑制活性的实验流程图。步骤1:BMDCs免疫前六天，准备不同组衍生自C57BL/6小鼠骨髓细胞的BMDCs。步骤2和步骤3:BMDCs免疫前一天将C57BL/6小鼠以IGy照射，然后将小鼠以静脉注射OT-1脾脏细胞(4 X 17细胞/鼠)。第4步:收集各种不同的BMDCs (5X 14细胞/小鼠)，然后于第O天以皮下注射到6-8周龄之OT-1脾脏细胞-重建的B6小鼠。步骤5:BMDCs刺激后第7天，牺牲各实验组小鼠并从各小鼠收集脾脏细胞，然后置于96孔U底平盘中以0VA(1 μ g/mL)或对照组胜肽RAH(1 μ g/mL)刺激。以3H-胸腺嘧啶核苷并入法测定脾脏细胞的增生活性(步骤6)。(D)收集来自经过或未经GRO-γ处理之C57BL/6小鼠骨髓细胞的BMDCs，并以0VA257_264胜肽施予脉冲。待使用清洗缓冲液除去未结合的胜肽后，将不同的BMDCs制备物再悬浮于150 yL的PBS中，然后以皮下注射入以OT-1脾脏细胞(4 X 17细胞/小鼠)重建之于受照射的C57BL/6小鼠中。于BMDCs投药后第7