一种具抑菌活性的天然产物胡桃素及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核桃青皮抑菌活性部位的提取分离和一种具有抑菌活性的天然产物 胡桃素及其制备方法，具体涉及通过生物活性追踪从核桃青皮中提取分离鉴定出具有抑菌 活性的天然化合物胡桃素及其制备方法。 技术背景
[0002] 核桃为胡桃科核桃属（juglans L )植物，具有巨大开发价值，在我国广泛栽培，种 植面积与产量均居世界第一位，其根、树皮、叶、外果皮均可入药，核桃或核桃楸的未成熟外 果皮（青龙衣）具有抗炎、镇痛、抑菌作用及显著的抗癌活性。现代研究表明，核桃青皮主 要含有萘醌及其苷类、黄酮类、二芳基庚烷类、留体等成分，具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗病 毒及杀虫活性。
[0003] 我国年产核桃青皮近100万吨，除少数用于药物外，大多数作为废弃物堆在田间 地头，因此寻找其抑菌活性成分，进而开发环境友好型植物源杀菌剂，具有广阔前景。
【发明内容】
[0004] 本发明采用化学提取法，从废弃核桃青皮中提取对葡萄蔓枯、葡萄溃疡、辣椒疫霉 等植物致病病原菌有抑制作用的活性成分，并制成植物源杀菌剂。
[0005] 本发明的一个目的在于提供一种从废弃核桃青皮中获得的具抑菌活性化合物胡 桃素，其特征在于胡桃素为大环二芳基庚烷类化合物，具有C21H24O5分子式，化学结构式如式 (I)
[0006]
[0007] 本发明提供的化合物胡桃素 NMR数据为1H NMR(400MHz，CDCl3) δ 6. 90 (1H，d，J = 8. 4Hz), 6. 82 (1H, d, J = 8. 4Hz), 6. 69 (dd, J = 8. 2, 2. 0Hz, 1H), 6. 58 (1H, d, J = 8. 4Hz), 5. 99 (1H, s) ,5. 56 (1H, d, J = 2. 1Hz), 3. 97 (3H, s), 3. 94 (3H, s), 3. 16 (1H, dt, J = 13. I, 5. 6Hz) ,2. 99 (1H, dd, J = 16. 1,8. 1Hz), 2. 75 (1H, dd, J = 12. 5,10. 6Hz), 2. 44-2. 33 (2H, m) ,2. 33-2. 24 (1H, m) , 2. 08(1H, ddd, J = 18. 8, 10. 9,5. 0Hz) , I. 86-1. 75 (2H, m), I. 74-1. 71 (1H, m)，I. 6卜I. 52(2H, m) ;13C 匪R(101MHz，CDCl3) δ 210. 1，149. 1，148. 0， 146. 6,145. 6,139. 8,134. 4, 126. 1,124. 9,121. 7,115. 9, 112. 1,61. 6,56. 3,46. 2,41. 2, 29. 9,27· 2,24. 8,19. 1。
[0008] 本发明的另一个目的是提供所述天然抑菌活性化合物的制备方法，其特征在于该 方法包括原料收集处理、粗提物提取、分离纯化鉴定及活性追踪四个步骤：
[0009] A、原料收集处理：收集废弃核桃青皮，自然阴干，低温保存；
[0010] B、粗提物提取：采用甲醇或80-95% (V/V)乙醇对原料三次冷浸提取，减压浓缩得 粗提物溶液；
[0011] C、分离纯化及鉴定：将粗提物水溶液分成若干份，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸 乙酯进行液液分配顺序萃取得到？1'1、？1'2、？1'3三个萃取组分；石油醚萃取组分？1' 1进行硅胶 柱层析，用石油醚与乙酸乙酯不同体积比例混合组成的洗脱剂，按极性由小到大梯度洗脱， 收集洗脱剂极性在5 : 1(石油醚：乙酸乙酯）的流分Fr1ULC检测合并相同组分，减压 浓缩；流分Fr1I以石油醚与乙酸乙酯体积比为3 : 1的展开剂进行制备TLC纯化，核磁鉴 定，得到胡桃素；
[0012] D、活性追踪：采用活性追踪法，将初提物、萃取物、分离流分依次进行室内抑菌生 测，选取抑菌活性较高部分进行后续试验，最终追踪分离到抑菌活性物质胡桃素。
[0013] 本发明具有以下有益效果：
[0014] 1、具有抑菌活性的天然活性产物胡桃素来源于废弃的核桃青皮，安全性高、属废 弃资源再利用。
[0015] 2、本发明所述的化合物提取分离制备方法，工艺简单、安全可行。
【具体实施方式】
[0016] 为了更清楚地阐述本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：
[0017] 实施例1 :核桃青皮甲醇初提物的提取
[0018] 取自然阴干的核桃青皮3. 5kg，加入IOL甲醇冷浸搅拌提取三次（5dX3)，37°C减 压蒸馏，得膏状初提物120g。
[0019] 实施例2 :核桃青皮乙醇初提物的提取
[0020] 取自然阴干的核桃青皮200g，加入1000ml95%乙醇冷浸搅拌提取三次（5dX3)， 37°C减压蒸馏，得膏状初提物6. 5g。
[0021 ] 实施例3 :核桃青皮甲醇初提物的萃取
[0022] 取IOg甲醇初提物，溶解于250ml蒸馏水，置于分液漏斗中，分别用3 X 100mL石油 醚（30-60°C )、三氯甲烷、乙酸乙酯顺序萃取，37°C减压蒸馏得石油醚萃取相0. 7g，三氯甲 烷萃取相0. 97g，乙酸乙酯萃取相0. 7g。
[0023] 实施例4 :核桃青皮乙醇初提物与萃取物抑菌活性研究
[0024] 采用菌丝生长速率法，将按本发明获得的核桃青皮80%乙醇初提物和萃取物在无 菌条件下分别配制成lg/ml (以干样计）和20mg/ml含0. 5%吐温-80的药液；吸取200ul 药液，注入冷却的90mmPDA培养皿中，均匀涂布后静置吸收，制成带药平板，每个处理3皿， 以200ul0. 5%吐温-80溶液做对照。葡萄蔓枯、葡萄溃疡、辣椒疫霉菌株活化后，菌落边缘 制取直径7mm菌饼，反接于带药平板中央，置于28°C培养箱中正置培养24h后倒置暗培养。 分别于48h、72h用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。试验结果见表1、表2。
[0025] 抑制率（％ )=[(对照菌落直径-处理菌落直径V(对照菌落直径-菌饼直 径）]X100
[0026] 表1核桃青皮乙醇提取物对三种病原真菌抑制作用
[0027]
[0028] 表2核桃青皮乙醇提取物的萃取物对三种病原真菌抑制作用
[0029]
[0030] 实施例5 :核桃青皮中胡桃素的提取分离
[0031] A、原料收集处理：收集废弃核桃青皮适量，自然阴干，低温保存。
[0032] B、浸膏提取：取阴干核桃青皮15kg，加入6倍量80 %乙醇，冷浸搅拌提取三次 (5d X 3)，过滤合并，减压回收溶剂得水溶液。
[0033] C、萃取分离：将所得水溶液分成若干份，依次用1倍量石油醚（30-60°C )、三氯 甲烷、乙酸乙酯顺序萃取各3次，合并40°C减压蒸馏，分别得萃取物浸膏Fri21g、Fr226g、 Fr342g。取石油醚相萃取物Fr1Wg,用38g硅胶（230-400目）拌样，760g硅胶（230-400目） 上普通玻璃层析柱，石油醚（30-60°C):乙酸乙酯（9 : 1-1 : 1+10%甲醇）梯度洗脱， 200ml为一流分，减压蒸馏，用薄层色谱（TLC)在256nm紫外灯下或碘显色后合并相同组分， 得 Fr1-I (0.79g，9 : IhFr1KS-OSgJ : 1)41^-3(4.4(^,7 : l)、Frr4(0· 45g，7 : 1)、 Fri-5(0.49g，5 : l)、Fri-6(3.4g，4 : l)、Fri-7(0.55g，3 : 1)7 个组分。15mg 组分 Fr1-S 用制备薄层色谱，以石油醚（30-60°C):乙酸乙酯（3 : 1)为展开剂，在256nm紫外灯下或 碘显色刮取相同条带，IOg硅胶（230-400目）上普通玻璃层析柱，乙酸乙酯洗脱，得到核桃 素 7mg。
[0034] 实施例6 :核桃青皮石油醚萃取物分离流分抑菌活性研究
[0035] 采用菌丝生长速率法，将按本发明获得的核桃青皮石油醚萃取物分离流分在无菌 条件下分别配制成6mg/ml含0. 5 %吐温-80的药液；吸取200ul药液，注入冷却的90mmPDA 培养皿中，均匀涂布后静置吸收，制成带药平板，每个处理3皿，以200ul0. 5%吐温-80溶液 做对照。葡萄蔓枯、葡萄溃疡、辣椒疫霉菌株活化后，菌落边缘制取直径7mm菌饼，反接于带 药平板中央，置于28°C培养箱中正置培养24h后倒置暗培养，72h后用十字交叉法测量菌落 直径，计算菌丝生长抑制率。试验结果见表3。
[0036] 抑制率（％ )=[(对照菌落直径-处理菌落直径V(对照菌落直径-菌饼直 径）]X100
[0037] 表3核桃青皮石油醚萃取物分离流分对三种病原真菌抑制作用
[0038]
【主权项】
1. 一种具有抑菌活性的天然产物胡桃素，其特征在于该胡桃素为大环二芳基庚烷类化 合物，具有C21H24O5分子式，化学结构如式（I)2. 如权利要求1所述的具抑菌活性天然产物胡桃素的制备方法，其特征在于该方法包 括原料收集处理、粗提物提取、分离纯化鉴定及活性追踪四个步骤： A、 原料收集处理：收集废弃核桃青皮，自然阴干，低温保存； B、 粗提物提取：采用甲醇或80-95% (V/V)乙醇对原料三次冷浸提取，减压浓缩得粗提 物溶液； C、 分离纯化及鉴定：将粗提物水溶液分成若干份，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯 进行液液分配顺序萃取得到？1~1、？1' 2、？1'3三个萃取组分；石油醚萃取组分？1'1进行硅胶柱层 析，用石油醚与乙酸乙酯不同体积比例混合组成的洗脱剂，按极性由小到大梯度洗脱，收集 洗脱剂极性在5 : 1(石油醚：乙酸乙酯）的流分Fr1ULC检测合并相同组分，减压浓缩； 流分Fr1I以石油醚与乙酸乙酯体积比为3 : 1的展开剂进行制备TLC纯化，核磁鉴定，得 到胡桃素； D、 活性追踪：采用活性追踪法，将初提物、萃取物、分离流分依次进行室内抑菌生测，选 取抑菌活性较高部分进行后续试验，最终追踪分离到抑菌活性组分胡桃素。3. -种权利要求1所述的天然活性产物的应用，其特征是在制备杀菌药物方面的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有抑菌活性的天然产物胡桃素及其制备方法。具体涉及采用提取、萃取及硅胶柱层析法，通过生物活性追踪从核桃青皮抑菌活性部位提取分离出具有抑菌活性的天然化合物，经核磁鉴定确定该物质为大环二芳基庚烷类化合物胡桃素，分子式为C21H24O5，具较高生物活性与环境安全性，展示出其作为杀菌剂或化学合成先导化合物的广阔开发前景。
【IPC分类】A01P3/00, C07D313/00, A01N43/22
【公开号】CN104961719
【申请号】CN201510280099
【发明人】王有年, 任建军, 黄支权, 刘柳
【申请人】北京农学院, 北京光禾生物科技有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年5月28日