水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌hp90的发酵培养基及培养方法

文档序号:9245891阅读:321来源:国知局
水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌hp90的发酵培养基及培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物的培养基,特别涉及水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌HP90的发 酵培养基。
【背景技术】
[0002] 米渣蛋白是以早籼米、陈化米等为原料生产怡糖、味精、葡萄糖、糊精、淀粉等产品 后剩下的副产物残渣,其价格低,产量大,几乎每消耗7kg大米就会有lkg米渣生成。米渣 中蛋白质含量为40%~70%,是大米整粒中蛋白质含量的5~8倍,且高于大豆中蛋白质 含量,被认为粮食蛋白中的最佳者。目前,我国主要将这些米渣蛋白经过简单的粉碎工艺制 程干粉,低价的卖给饲料厂作饲料,其价值远未能得到合理和充分利用。若将这些蛋白转化 成高附加值的多肽和氨基酸,这对提高其生物效价、经济价值和我国稻谷深加工的技术含 量都有重要意义。
[0003] 米渣蛋白转化成多肽和氨基酸常用酸或商品蛋白酶。酸法水解迅速、彻底,但其 在极端温度和pH下进行,对氨基酸、蛋白质破坏严重,对单糖和多糖大部分破坏使得水解 液呈黑色,不利于后续工序;还能与原料中油脂生成有毒和致癌的氯丙醇类物质,污染环 境。而商业蛋白酶能提高蛋白质理化功能和感官特性,绿色安全,并广泛用于食品、洗涤剂、 药物及皮革业等。同时,商业酶也存在一定的不足:商品酶法由于酶的专一性,须使用多种 蛋白酶结合作用于米渣,而不同酶的作用条件又不一样,导致其活性受环境影响很大;由于 原料中一些蛋白被淀粉等包裹起来,还需加入糖化酶等释放出蛋白质,使得工艺流程复杂 化;因酶本身成本和回收成本较高,工业化应用于米渣成本高。产酶菌株直接应用于蛋白 质,因其酶系丰富可充分利用底物;可扩大培养制成种子液或冻干菌粉大规模使用成本较 低;在发酵过程中其酶活较商品酶稳定;为产酶菌株代替商品酶水解米渣蛋白提供理论依 据。此法不仅兼有酶法的优点,而且可降低生产成本,可循环利用,简单方便。此外,产米渣 蛋白水解酶菌株直接应用于米渣蛋白的水解还非常少见。为此,申请人已研宄出《一株水 解米渣的蛋白酶产生菌枯草芽孢杆菌及其筛选与使用方法》,且申请了中国专利,申请号为 201410474539. 4,该申请件已于2015年3月04日公布。
[0004]目前中国专利数据库中,涉及杆菌培养基的申请件多达上百件,例如, ZL2010105960593号《一种副猪嗜血杆菌5型高密度发酵培养基及应用》、ZL201110099582X 号《一种应用于微生物肥料的枯草芽孢杆菌深层发酵培养基》、ZL2012102784847号《一种苏 云金芽胞杆菌乳化发酵培养基》、ZL2013100415664号《一种促进地衣芽孢杆菌BL63516生 长的发酵培养基及发酵培养方法》和ZL2013101899388号《一种枯草芽孢杆菌发酵培养基》 等。迄今为止,尚无水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌发酵培养基的申请件。

【发明内容】

[0005] 本发明旨在提供水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌HP90的发酵培养基,通过优化发 酵培养基来提高枯草芽孢杆菌HP90对米渣蛋白的水解度。
[0006] 本发明的又一目的在于提供优化发酵培养基的培养方法,使前述的发酵培养基得 以实际应用。
[0007] 发明人提供的水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌HP90的发酵培养基各组分含量为 (g/L):米渣9. 7、氯化钠5. 0、七水硫酸镁0. 2、氯化钙0. 1、磷酸氢二钾5. 0,其余为水;培养 基pH为 7. 35;
[0008] 所述米渣购于山东博兴县晓旭饲料贸易有限公司。
[0009] 上述水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌HP90已于2014年5月18日保藏于武汉中 国典型培养物保藏中心,该中心地址是:中国武汉?武汉大学,邮政编码:430072;简称枯 草芽孢杆菌HP90,保藏编号为CCTCCN0.M2014201,分类命名:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株系从中国贵州传统豆鼓中分离得到。
[0010] 发明人提供的HP90发酵培养基的培养方法是将枯草芽孢杆菌HP90接种于种子培 养基,于30°C、180r/min下培养24h,制得发酵用种子液;再将发酵种子液按照7%的接种量 接种于上述发酵培养基中,在30°C、180r/min下培养60h;按此方法,米渣蛋白水解度可达 28. 23%〇
[0011] 上述种子培养基的各组分(g/L)是:米渣15. 0、氯化钠5. 0、七水硫酸镁0. 2、氯化 妈0. 1、磷酸氢二钾5. 0,自然pH,其余为水,于121°C灭菌20min。
[0012] 米渣蛋白水解度的计算公式=(菌株水解米渣蛋白的含量/发酵培养基中米渣蛋 白的含量)X100 %
[0013] 本发明的水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌HP90发酵培养基是一种优化培养基,用 于发酵生产的蛋白酶可高效催化米渣蛋白的水解,且发酵条件容易实现,条件温和,易于控 制,有利于工业化生产。采用本发明优化后的培养基及条件,该枯草芽孢杆菌HP90对米渣 蛋白的水解度可达28. 23 %,与优化前相比提高了 42 %。本发明适用于培养枯草芽孢杆菌。
【附图说明】
[0014] 图1为发酵液pH对菌株HP90水解米渣蛋白水解度的影响;
[0015] 图2为不同接种量对菌株HP90水解米渣蛋白水解度的影响;
[0016] 图3为不同发酵时间对菌株HP90水解米渣蛋白水解度的影响;
[0017] 图4为不同米渣浓度对菌株HP90水解米渣蛋白水解度的影响。
【具体实施方式】
[0018] 本发明用下列实施例来进一步说明
【发明内容】
,但是本发明的保护范围并不限于下 列实施例。
[0019] 实施例1
[0020] 以下为本发明所涉及到的培养基及方法
[0021] (1)种子培养基(g/L):米渣15. 0、氯化钠5. 0、七水硫酸镁0. 2、氯化钙0. 1、磷酸 氢二钾5. 0,自然pH,其余为水,于121°C灭菌20min
[0022] (2)发酵种子液的制备:将斜面枯草芽孢杆菌HP90接种于种子培养基,30°C、 180r/min培养24h,即为发酵种子液。
[0023] (3)发酵培养基(g/L):同种子培养基。
[0024] (4)发酵液的制备:将发酵种子液按6%的接种量接种于发酵生产培养基中30°C、 180r/min下培养48h,然后在4°C,10000r/min的条件下离心lOmin得发酵上清液。
[0025] 实施例2
[0026] 单因素试验设计
[0027] 在30°C、180r/min条件下,以不同的水解pH、时间、接种量及米渣浓度分别考察枯 草芽孢杆菌HP90水解米渣的条件,以米渣蛋白水解度为指标确定菌株水解米渣的作用条 件范围,具体如下:
[0028] (1)水解pH值对米渣水解度的影响
[0029] 水解时间48h,接种量6%,米渣浓度1. 5g/100mL,发酵培养基pH分别调至5、6、7、 8、9,
[0030] (2)水解时间对米渣水解度的影响
[0031]pH7,接种量6%,米渣浓度1. 5g/100mL,发酵培养时间分别取24h、36h、48h、60h、 72h〇
[0032] (3)接种量对米渣水解度的影响
[0033] pH7,水解时间48h,米渣浓度1.5g/100mL,接种量分别为2%、4%、6%、8%、 10%〇
[0034] (4)米渣蛋白含量对其水解度的影响
[0035]pH为7,水解时间为48h,接种量为发酵液的6 %,米渣蛋白含量分别为0. 5 %、 1. 0%、1.5%、2. 0%、2. 5%〇
[0036] 单因素试验结果见图1~图4。
[0037]Box-Benhnken试验设计
[0038] 在上述单因素实验的基础上进行Box-Benhnken试验设计,优化了枯草芽孢杆菌 HP90水解米渣的作用条件。选取水解pH值、水解时间、接种量及米渣浓度为研宄对象,以米 渣蛋白水解度作为响应值,通过响应面分析对发酵条件进行优化。实验设计见表1,实验结 果表2,实验结果分析见表3。
[0039] 表1菌株HP90水解米渣的响应面分析因素和水平
[0041]表2菌株HP90水解米渣蛋白的Box-Behnken试验结果
[0042]
[0043]
[0044]采用Design-Expert软件对表2中的米澄蛋白水解度的数据进行方差分析及多元 回归拟合,得到了各影响因子的显著性(表3),获得枯草芽孢杆菌HP90水解米渣蛋白水解 度(Y)对自变量发酵液的pH(X)、发酵时间(X2)、接种量(X3)及底物浓度(X4)的二次多项 回归模型方程为:
[0045]Y= +25. 70+0.SSXi+O. 65X2+0. 23Xs-〇. 35X4+0. 82X1X2+0. 44X1X3-〇. 13X1X4+0. 39X2X3 -0? 29X2X4-0. 14X3X4-2. 26X/+0. 39X22+0. 55X32-6. 74X42。
[0046] 利用Design-Expert软件对回归方程进行最值求解,得到模型极值点即发酵液的 pH(Xi)为7. 35、接种量(X3)为7%、发酵时间(X2)为60h、米渣浓度(X4)为0? 97g/100mL时, 对米渣蛋白水解度达到最大值,为28. 23 %。
[0047] 以上实施方式仅是本发明的具体例子,显然本发明的实现并不受上述方式的限 制。只要采用本发明的方法构思和技术方案进行的非实质性改进,或未经改进将本发明的 构思和技术方案直接应用于其他场合的,均在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌HP90的发酵培养基,其特征在于该发酵培养基各组 分含量以g/L计为:米渣9. 7、氯化钠5. 0、七水硫酸镁0. 2、氯化钙0. 1、磷酸氢二钾5. 0, 其余为水;培养基pH为7.35 ; 所述米渣购于山东博兴县晓旭饲料贸易有限公司。2. 如权利要求1所述的发酵培养基,其特征在于所述水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌 HP90已于2014年5月18日保藏于武汉中国典型培养物保藏中心,该中心地址是:中国 武汉?武汉大学,邮政编码:430072 ;简称枯草芽孢杆菌HP90,保藏编号为CCTCC NO. M 2014201,分类命名:枯草芽抱杆菌3. 如权利要求1所述的HP90发酵培养基的培养方法,其特征在于将枯草芽孢杆菌 HP90接种于种子培养基,于30°C、180r/min下培养24h,制得发酵用种子液;再将发酵种子 液按照7%的接种量接种于上述发酵培养基中,在3〇1:、18〇17 /111111下培养60 11;按此方法, 米渣蛋白水解度可达28. 23%。4. 如权利要求3所述的方法,其特征在于所述种子培养基的各组分以g/L计是:米渣 15. 0、氯化钠5.0、七水硫酸镁0.2、氯化钙0.1、磷酸氢二钾5.0,自然pH,其余为水,于121 °C灭菌20 min得到。
【专利摘要】水解米渣蛋白的枯草芽孢杆菌HP90的发酵培养基,该发酵培养基各组分含量以g/L计为:米渣9.7、氯化钠5.0、七水硫酸镁 0.2、氯化钙 0.1、磷酸氢二钾5.0,其余为水;培养基pH为 7.35。培养方法是将枯草芽孢杆菌HP90接种于种子培养基,于30℃、180r/min下培养24h,制得发酵用种子液;再将发酵种子液按照7%的接种量接种于上述发酵培养基中,在30℃、180r/min下培养60 h。本发明的HP90发酵培养基是一种优化培养基,用于发酵生产的蛋白酶可高效催化米渣蛋白的水解,且发酵条件容易实现,条件温和,易于控制,有利于工业化生产。
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/125
【公开号】CN104962493
【申请号】CN201510351529
【发明人】何腊平, 薛荣涛, 李翠芹, 王猛, 张明赞
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月24日
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