一种高产磷脂酶c的蜡状芽孢杆菌突变株及发酵方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物技术、微生物工程和制药工程的领域，具体涉及到一株高产磷 脂酶C的蜡样芽孢杆菌突变株，还涉及到该突变株的发酵方法，还涉及到该突变株在制备 磷脂酶C的应用。 技术背景
[0002] 一、磷脂酶C的生理活性及市场
[0003] 生物细胞膜是由50%以上的磷脂及其脂质组成，磷脂由甘油磷脂和鞘磷脂组成。 磷脂不但在细胞代谢、信号传导及细胞生理活性的维持中起着非常重大的作用，而且在血 小板的粘附作用和聚集作用中起着关键作用。血小板的粘附和聚集可引起人血栓的形成， 血栓可阻止机体组织出血，有利于止血作用，使人不至于出血过多引起生命垂危；但在大多 数状态下，血栓造成的血管腔阻塞及其对机体的影响。血栓导致心肌梗塞、脑梗死、急性冠 状动脉综合症，外周动脉疾病和肺栓塞等疾病，不但危及人类生命，而且造成大量的残疾人 员，使许多人尤其是老年人瘫痪，卧床不起，痴呆等等，对本人亲属和社会造成很大的损失 和负担。
[0004] 据报道，全球每年死于各类血栓病的人数有2600万人，占死亡总人数的29%，是 排在导致人类死亡的心血管疾病、传染病和癌症三大因素之首。在我国每年有300万以上 的人死于各种心脑血管疾病，占总死亡率的45%左右，也排在死亡因素之首。可见研制新的 抗血栓药物非常之必要且意义非常重大。
[0005] 在近十年中，由于全球老年化进程加快，抗血栓药从2005年的133亿美元增加到 2010年的230亿美元，年平均增长11. 6%，其中2009年，仅抗血栓药氯吡格雷销售额98亿 美元，另一个依诺肝素销售42亿美元。预计2015年抗血栓药物达到市场销售规模340亿 美元，约合人民币2100多亿元。这是一个巨大的数字。曾有报道，日本的一种一类新药拯 救一个药厂，一个公司的存活，甚至一个国家人民的新生。
[0006] 我国抗血栓药物市场规模一直增长很快，由2007年的35. 2亿元增长到2011年的 81. 35亿元，最近四年平均复合增长率23. 3%，远远超过了国家⑶P的增长率。预计2015 年我国老年人可达1. 8亿人，老年人口的快速加剧，其面临心脑血管疾病发病率和死亡率 也将快速增加。抗血栓药物将获得大量应用和收益。抗血栓药物市场规模可达170亿元， 比2011年增长1倍多。
[0007] 二、抗血小板药物
[0008] 血小板在止血、血栓形成、动脉粥样硬化等过程中起着重要作用。抗血小板药物主 要通过抑制花生四烯酸代谢，增加血小板内CAMP浓度等机制而抑制血小板粘附、聚集和分 泌功能。
[0009] 我们研宄获得从微生物中提取的磷脂酶C(phosopholipase,简写PLC，下同）经 过兔、狗以及人的试验，具有预防血栓形成，溶栓的功能，并改变蛋白多肽药物注射剂而成 为口服剂，使患者口服方便，减少痛苦和心理负担，制剂稳定性能好，抗血小板功能效果好。PLC制剂无毒性且安全。
[0010] 三、PLC产生菌
[0011] 在国外，对PLC产生菌研宄较早，陆续发现在G+Bacilluscereus，B. thuringiensis*G_Pseudomonadaeruginosa等十多种微生物中产生PLC。在国内，陈涛等 报道了粘附沙雷氏菌武汉株CW-W-90-3产生PLC，后来又报道出蜡样芽孢杆菌深圳株754-1 产生PLC，因为该菌为芽孢杆菌，存活期长，易于保存，稳定性能好。因而，目前研宄多集中于 B.cereus和B.thuringiensis这两种芽抱杆菌，它们均为革兰氏阳性菌。因为许多革兰氏 阴性菌产生的PLC具有溶血而无实际应用价值。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供了一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株，该菌株高产 磷脂酶C，该菌株已于2015年5月6日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号 为CCTCCNO:M2015277,分类命名：蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus)III-2-6,地址：中国 武汉武汉大学。
[0013] 本发明另一个目的在于提供一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株的发酵方 法，本发明提供的方法简化了制备工艺和设备，适于大规模生产。
[0014] 本发明最后一个目的在于提供一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株在制备 磷脂酶C(phosopholipase,简写PLC)制剂中的应用。
[0015] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施。
[0016] -种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株，通过以下方式筛选得到：
[0017] 活化蜡样芽孢杆菌深圳株754-1株，将该菌株在LB培养基稀释生长，有明显分解 卵黄特征，培养2-3天后，洗成菌悬浮液，备用。
[0018] 将制备好的处理菌悬浮液，进行等离子辐射诱变，诱变分三种不同剂量进行，每个 剂量处理菌稀释液2ml。处理完毕，用黑布包裹严实带回实验室进行卵黄琼脂平皿分离筛 选。
[0019] 将筛选到的突变株，经过摇瓶发酵三批，经离心分离，将上清液用卵黄琼脂杯碟法 测定，再经过NPPC法测定PLC含量，最终筛选出突变株III-2-6,该菌株已于2015年5月6 日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCCN0:M2015277,分类命名：蜡 状芽孢杆菌（Bacilluscereus) 111-2-6,地址：中国武汉武汉大学。
[0020] 该菌株具有典型的蜡状芽孢杆菌的生理生化特征，如VP反应、吲哚产生、产H2S、氧 化酶、在7%和10%NaCl浓度下的生长情况以及在10°C和45°C下的生长情况等；该菌株具 有典型的蜡状芽孢杆菌的培养特性，如在营养琼脂平板上生长出乳白色、表面粗糙的菌落； 在液体摇瓶中由芽孢萌发成杆状的营养体，在生长后期形成孢子囊和芽孢。
[0021] 一种蜡状芽孢杆菌突变株的发酵生产方法，包括：
[0022] 将蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus)III-2-6种子液接种于半自动发酵罐中， 28±2°C，180-220rpm搅拌，通气量1:0. 8-1. 5 (v/v)，发酵16-22小时，，当显微镜观察到菌 营养体大多数为孢囊前期原生质凝集，没有形成明显孢子囊时，停止培养。放罐。
[0023] 以上所述的方案中，发酵罐中的发酵培养基配方包括：蛋白胨0.7%，牛肉膏 0. 3%，酵母浸膏0. 2%，葡萄糖0. 1%，尿素0. 1%，pH7. 0-7. 5,以上均为质量比。
[0024] 以上所述的方案中，种子液的接种量为5-10% ;
[0025] 以上所述方案中，种子液的浓度为108_10 9个菌/ml或OD值0. 2-0. 3;
[0026] 以上所述方案中，发酵培养基的装液量为发酵罐容积的3/5。
[0027] 一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株在制备磷脂酶C(phosopholipase，简写 PLC)制剂中的应用，包括将制得的发酵上清液利用常规方式浓缩后与其他辅料混合制备粉 剂，片剂或其他医学上承认的剂型。
[0028] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0029] 一、菌种为蜡状芽孢杆菌突变株，一是容易保藏，存活时间长，冻干后菌种可存活 十年以上；
[0030] 二、是芽孢杆菌抗逆性强，稳定性好，不易衰退，长期保存后，产PLC酶量及酶活均 能有较好的稳定性。
[0031] 三、该菌株较原出发株产PLC酶活高，且易于在改良的LB培养基中发酵生产，生长 期短，16-22小时，经NPPC法检测，PLC酶活单位在24. 5u/ml发酵液以上。
【具