一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因测序领域，具体地，涉及一种基于杂交原理的目标序列捕获系统， 更具体地，涉及一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法。
【背景技术】
[0002] 新一代测序技术的发展，为现代基因组学的研宄打开了新的局面，然而全基因组 测序的成本和分析的复杂程度还是让研宄人员倍感困难，目标序列捕获技术的出现，缓解 了这些问题。目标序列捕获测序是针对已知的特定基因组区域设计探针后进行的测序。外 显子组捕获测序则是其中的一个特例，它是专门针对基因组中全部外显子区域的研宄。全 基因组外显子测序是利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高 通量测序的基因组分析方法。由于其具有对常见和罕见变异高灵敏度，能发现外显子区绝 大部分疾病相关变异以及仅需要对约1%的基因组进行测序等优点，促使全基因组外显子 测序成为鉴定如孟德尔疾病等疾病的致病基因最有效的策略，也被运用于复杂疾病易感 基因的研宄和临床诊断中。
[0003] 目标序列捕获是指通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定片段。从 这个定义看，目标片段的PCR也是目标序列捕获的一种，不过这种方法通量小，目前一次 PCR获取最长的基因组DNA片段不超过50Kb，而且需要特殊的酶和特殊的PCR条件，成本昂 贵，稳定性差。另一种捕获方法是根据核酸分子碱基互补的探针，将这些探针固定在某些支 持物上，用于分离，然后打断基因组DNA，加上街头后与探针杂交，洗脱为杂交上的DNA，回 收目标DNA片段，可直接建库进行DNA测序。
[0004] 尽管已有商品化的外显子捕获试剂盒，但是目前的捕获物种有限，仅限于人类和 鼠，成本极其昂贵（每个样品需350美金）等缺陷。
[0005]目前，市售的有安捷伦（Agilent)公司推出的SureSelect目标序列捕获系统以及 罗氏NimbleGen推出的基于HD2平台2. 1M外显子序列捕获芯片。其中，SureSelect目标序 列捕获系统是RNA，难以保存，极易降解；与基于HD2平台2. 1M外显子序列捕获芯片相比， 实验过程简单，价廉。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种全基因组外显子序列捕获探针的构建方法，所述方法 包括以下步骤：
[0007] (1)提取正常血液中的总RNA，提取并打断mRNA ;
[0008] (2)用SuperscriptII(invitrogen)合成一链cDNA ;
[0009] (3)合成invitrogen的二链合成混合液合成cDNA ;
[0010] (4)补平末端，并在产物末端加A，连接接头；
[0011] (5)富集DNA片段。
[0012] 步骤⑴打断mRNA的方法为：
[0013] 用无核酸酶超纯水稀释总RNA，按1:1体积比（反应体系是50yL))加入纯化 磁珠（RNAPurificationBeads15026778illumina)，在 65°C孵育 5min，放在磁力架上 (DynaMag-2invitrogen)室温下孵育5min后，吸弃上清液，
[0014] 从磁力架上拿下，按5 :2体积比加入200yL洗脱液（150mMLiCl，20mMTris HC1(pH7.5)，l.OmMEDTA，0.01 %TritonX-100)，放在磁力架上（DynaMag_2invitrogen) 室温下孵育5min后，吸弃上清液，
[0015] 从磁力架上拿下，加入50yL洗脱液（100mMTris-HCl，pH8. 5，1. 25MNaCl，按体 积在80°C孵育mRNA洗脱液2min，按体积比1:1加入磁珠结合缓冲液（1MLiCl，40mMTris HCl(pH7.5)，2mMEDTA，0.l%TritonX-100)，放在磁力架上（DynaMag_2invitrogen)室温 下孵育5min后，吸弃上清液，
[0016] 从磁力架上拿下，加入200ul磁珠清洗液（150mMLiCl，20mMTrisHC1(pH7. 5)， l.OmMEDTA，0.01%TritonX-100)，放在磁力架上（DynaMag_2invitrogen)室温下孵育 5min后，吸弃上清液，
[0017] 加入 25yL洗脱液（（100mMTris-HCl，pH8.5，1.25MNaCl)，94°C孵育 4min。
[0018] 步骤⑵的合成一链cDNA的方法为：
[0019] 将步骤（1)获得的 17yLmRNA在磁力架（DynaMag_2invitrogen)静置 5min，取上 清液，
[0020] 按体积比 4:1 加一链合成混合液【50mMTris-Acetate，75mMKOAc，3.ImM Mg(0Ac)2,0.5mMdNTPseach】4yL，按照8:1 体积比加入0.1MDTT【P/NY00147invitrogen】 2yL，按照 16:1 体积比 10nMdNTP((P/NY00147invitrogen】（1yL)进行孵育 37°C2min，
[0021] 加入SuperscriptII5yL，
[0022] 孵育程序为：37°C60min，4°C保存。
[0023] 步骤（3)的合成二链cDNA的方法为：
[0024] 按体积比1:1向步骤（2)的一链cDNA体系中加入二链合成混合液30yL【20mM Tris-HCl,12mM(NH4)2S04,5mMMgC12,0. 16mM0-NAD,0. 19mMdNTPseach] ；E.coliDNA Ligase(lOunits/yL【P/NY01181invitrogen】lyL、E.coliDNAPolymerase(lOunits/yL 【P/NY0116invitrogen】4iiL、E.coliRNaseH(2units/yL)liiL，
[0025] 16°C孵育2h，加入纯化磁珠90yL(AMPureXPbeadsA63881)，移液器混匀10次， 室温孵育15分钟，放在磁力架5分钟后，转移上清液135yL，
[0026] 按照体积比7:10在上清液中加入80%的乙醇，吸去上清，重复一次，室温干燥 15min，
[0027] 加入 52. 5yL的重悬混合液（50mMTris-HCl,pH8. 0 10mMEDTA)，
[0028] 室温孵育2分钟，放置磁力架上5分钟后转移上清液。
[0029] 步骤⑷的补平末端是指：
[0030] 向步骤（3)获得的上清液50yL中加入重悬混合液（(50mMTris-HCl，pH8. 0 10mMEDTA))和EndRepairMix【10000units/mlT4PolynucleotideKinase，3000units/ mlT4DNAPolymerase】，分别按照5:1的体积比和5:4的体积比添加，充分混勾；
[0031] 30°C孵育30min，加入160yL纯化磁珠，混动10次，室温孵育15分钟，放在磁力架 上5分钟，吸弃上清，
[0032] 加入80 %的乙醇200yL，吸去上清，重复一次，室温干燥15分钟，
[0033] 加入17. 5 y L重悬混合液，室温孵育2分钟，放置磁力架上5分钟后转移上清液。
[0034] 步骤⑷的产物末端加A是：
[0035] 在补平末端后的转移上清液15yL中，加重悬混合液和加A混合液（重悬混合液： 50mMTris-HCl，pH8.0 10mMEDTA;加A混合液：10mMTris-HCl，10mMMgCl2,50mMNaCl， ImMDTT，0. 2mMdATP)，充分混匀，重悬混合液和加A混合液与上清液的体积比分别为6:1 和 6:5 ;37°C孵育 30min。
[0036] 步骤⑷的连接接头的方法是：
[0037] 在加A后的溶液30yL中加入连接混合液【66mMTris-HCl，10mMMgC12，lmM dithiothreitol，lmMATP，6%Polyethyleneglycol(PEG6000)】、重悬混合液、标签适配 器混合液（66mMTris-HCl，10mMMgC12,ImMdithiothreitol，ImMATP，6%Polyethylene glycol(PEG6000))，】、其与加A后溶液的体积比均为12:1，30°C孵育lOmin;再按照7. 5 :1 的体积比加入连接终止液【0. 5MEDTA】，混动10次，
[0038] 按与混合溶液体系的体积比1:1加入纯化磁珠，混动10次，室温孵育15分钟放在 磁力架上5分钟，
[0039] 吸弃上清，加入80%的乙醇200yL，吸去上清，重复一次，室温干燥15分钟，加入 22. 5yL的重悬混合液，室温孵育2分钟；
[0040] 放置磁力架上5分钟后转移上清液，纯化（纯化方法：加入纯化磁珠，混动10次， 室温孵育15分钟，放在磁力架上5分钟，吸弃上清，加入80%的乙醇200yL，吸去上清，重 复一次，室温干燥15分钟，加入重悬混合液，室温孵育2分钟，放置磁力架上5分钟后转移 上清液。）连接接头后的产物20yL。
[0041] 其中，步骤（5)富集DNA片段的方法为：将步骤（4)纯化连接接头后的产物进行 PCR扩增，所用引物对的序列为：
[0042]上游弓丨物：AAT(Bioti