检测牛ADIPOQ基因mRNA表达水平的特异性引物和荧光定量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及检测牛ADIP0Q基因mRNA表达水平的特 异性引物和荧光定量PCR检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR)是DNA体外操作技术中最 常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异性引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放 在同一个缓冲反应体系中，进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环，实现靶DNA 片段在反应液中呈2n倍扩增(其中n为热循环次数)。
[0003] 荧光定量PCR技术是在普通PCR反应的基础上，结合了实时荧光检测技术和计算 机分析技术。荧光定量PCR在普通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质，通过检测每 个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况，并获得每个 样本的荧光定量变化曲线，进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数）； 同时，在相同的反应体系和反应条件下检测2 (或10)倍稀释的已知数量的靶标DNA，获得 其Ct值，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和 各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
[0004] 虽然Northernblot技术可检测基因的mRNA表达水平，但整个实验过程操作比较 复杂。Northernblot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解，所以NorthernBlot中 所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程，如高温烘烤、DEPC处理等。另外，Northern Blot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验 虽然降低了实验人员的工作量，并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化，但 是其灵敏度较低。
[0005] 而SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后，其 荧光大大增强。该性质用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧 光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发 射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
[0006] SYBRGreen在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结 合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于 一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SRYBGreen的灵敏度很高。但是，由于SYRB Green与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引 起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产 物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreen得到定量结果。
[0007] 脂联素（Adiponectin，ADIP0Q)主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，是脂肪细 胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质。ADIP0Q同时也是一种胰岛素增敏激素，能改 善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症；对人体的研宄发现，ADIPOQ水平能预示II型糖尿病和 冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。ADIP0Q可作用 于骨骼肌增加脂肪酸氧化作用，同时还能作用于肝脏增加胰岛素拮抗糖异生作用，当脂肪 过度沉积时，ADIPOQ基因在脂肪组织中的表达量及血液ADIPOQ水平均降低；而体重下降 时，ADIPOQ的表达量和血液ADIPOQ水平均升高，ADIPOQ通过蛋白激酶促进骨骼肌脂肪酸的 氧化，降低脂质在骨骼肌的堆积，减少游离脂肪酸进入肝脏，改善肝脏胰岛素抵抗，降低肝 糖的生成和极低密度脂蛋白的合成。在动物生产中，动物体内脂肪沉积及脂肪含量是影响 肉品质的重要因素，动物产品脂肪含量过高不仅影响消费者的健康，而且降低饲料利用率。 ADIPOQ的研宄，为改善动物胴体品质、生长性能和脂肪沉积的分子育种研宄提供理论依据。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了检测脂联素（Adiponectin，ADIPOQ)基因mRNA表达水平的特异性引 物和荧光定量PCR检测试剂盒。通过大量的实验研宄，我们优化出了一套能够有效检测不 同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)ADIP0Q基因mRNA表达量的引物和PCR反应的条件，并组装 成ADIPOQ基因mRNA表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、动物医学 和动物科学研宄者的检测需要。
[0009] 本发明提供一种检测牛ADIPOQ基因mRNA表达水平的特异性引物，所述特异性引 物的核苷酸序列为： 上游引物序列为：5 ' -AGAAAGGGAGAACCTGGAGA-3 ' ； 下游引物序列为：5 ' -GGTAAAGCGAATGGGAACA-3 '。
[0010] 本发明的第二个目的是提供一种牛ADIPOQ基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检 测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物，所述特异性引物序列为： 上游引物序列为：5 ' -AGAAAGGGAGAACCTGGAGA-3 ' ； 下游引物序列为：5 ' -GGTAAAGCGAATGGGAACA-3 '。
[0011] 优选地，所述试剂盒还包括SYBR Green染料。
[0012] 优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0013] 优选地，所述阳性对照的核苷酸序列参见序列表中SEQIDNo. 3。
[0014] 本发明的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，是以待测cDNA为模板，利用 权利要求1所述的特异性引物和SYBRGreen染料进行实时荧光定量PCR，记录Ct值，并以 ADIPOQ标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和Ct值进行定量测定。
[0015] 优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件是：95°C预变性30秒；95°C5秒， 56. 0°C20秒，捕捉焚光信号，循环40次。
[0016] 本发明的第四个目的是提供一种牛ADIPOQ基因mRNA表达水平的定量检测方法， 是以待测cDNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和SYBRGreen染料进行实时荧 光定量PCR，记录Ct值，并以ADIPOQ标准基因作为阳性对照绘制标准曲线，据此标准曲线和 Ct值进行定量测定。
[0017] 优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件是：95°C预变性30秒；95°C5秒， 56. 0°C20秒，捕捉焚光信号，循环40次。
[0018] 本发明的第五个目的是提供权利要求1所述的特异性引物、权利要求2-5任一所 述的试剂盒、序列表中SEQIDNo. 3所述的核苷酸序列在定量检测牛ADIPOQ基因mRNA表 达水平中的应用；优选地，所述牛为黄牛、奶牛和牦牛。
[0019] 与现有技术相比，本发明的优点在于： 1.本发明实现了简便快捷的定量检测ADIP0Q基因mRNA表达水平的目的，可以监测不 同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)、不同组织、不同时期的ADIPOQ基因的mRNA表达状态。
[0020] 2.本发明在检测基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的 优点。
[0021] 3.本发明可以监测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛）脂联素（Adiponectin， ADIPOQ)基因mRNA转录水平，通过对该基因的研宄，可以改善动物胴体品质、生长性能和脂 肪沉积等性状。
【附图说明】
[0022] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为ADIPOQ基因mRNA表达水平的荧光检测结果图。其中，A:扩增曲线，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相对荧光量值（RelativeFluorescenceUnits，RFU);B:熔解曲线， 横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量（d(RFU)/dT)。
【具体实施方式】
[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0024] 其中，SYBRGreen染料购自宝生物工程(大连）有限公司。
[0025] 实施例1 本发明的ADIPOQ基因mRNA表达水平的荧光定量PCR检测试剂盒由以下组分组成：2XSYBRGREENMIX 5mL； 阳性对照：标准ADIPOQ基因模板 500 yL; 引物混合液 500yL; 超纯水 5mL。
[0026]其中，2XSYBRGR