针对wbgZ基因鉴定宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测宋内氏志贺氏菌的方法，尤其涉及一种针对WbgZ基因鉴定 宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR方法，本发明还涉及宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR检测 引物和试剂盒，属于宋内氏志贺氏菌的检测领域。
【背景技术】
[0002] 志贺氏菌仍然在世界许多国家和地区引发主要的健康问题，特别在不发达国家和 发展中国家由于缺乏清洁的水源、缺少必要的卫生医疗设备等诸多因素，导致志贺氏菌引 发的公共健康问题更加严重。世界范围内，志贺氏菌病在1~5岁或更大一点幼儿中发病 率和致死率最高。大多数志贺氏菌病与三种志贺氏菌息息相关，即福氏志贺氏菌、宋内氏志 贺氏菌和痢疾志贺氏菌。在这三种志贺氏菌中，宋内氏志贺氏菌主要在工业化国家被发现， 福氏志贺氏菌主要在发展中国家被发现，痢疾志贺氏菌是唯一引发流行和大流行志贺氏菌 病的菌株。
[0003]目前，在发展中国家由于缺乏准确可靠的鉴定技术，大多数志贺氏菌都无法鉴定 分群，对志贺氏菌的鉴定分群主要依靠常规生化鉴定方法、免疫学方法，这些方法比较复 杂、耗时耗力、敏感性低。也有一些学者研宄建立了分子生物学检测技术主要对志贺氏菌属 进行鉴定，但也存在一定的局限性而导致错检和漏检现象。因此，建立一种准确可靠的、快 捷的志贺氏菌鉴定分群技术显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR检 测的引物对及探针；
[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种鉴定宋内氏志贺氏菌的实时荧光 PCR方法；
[0006] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR 检测试剂盒。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0008] 本发明根据宋内氏志贺氏菌的WbgZ基因设计引物和探针。本发明首先公开了针 对wbgZ基因鉴定宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR的引物对及探针，其中，所述引物对由核 苷酸序列为SEQIDNo.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo. 2所示的下游引物组 成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 3所示；或者，
[0009] 所述引物对由核苷酸序列为SEQIDNo. 4所示的上游引物和核苷酸序列为SEQID No. 5所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.6所示；或者，
[0010] 所述引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.7所示的上游引物和核苷酸序列为SEQID No. 8所示的下游引物组成；所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo.9所示。
[0011] 本发明还根据ompA基因设计3对引物和探针作为内参照，所述内参照引物对由核 苷酸序列为SEQIDNo. 10所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo. 11所示的下游引物 组成，所述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 12所示；或者，所述内参照引物对由核苷酸序列 为SEQIDNo. 13所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo. 14所示的下游引物组成，所 述探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 15所示；或者，所述内参照引物对由核苷酸序列为SEQ IDNo. 16所示的上游引物和核苷酸序列为SEQIDNo. 17所示的下游引物组成，所述探针的 核苷酸序列为SEQIDNo. 18所示。
[0012] 本发明用17株志贺氏菌和19株非志贺氏菌对宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR 方法所用的引物和探针进行了特异性实验，结果表明，引物对和探针Sonl-F/Sonl-R/ Sonl-P(即由SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQID No. 3所示）特异性好，仅在宋内氏志贺氏菌出现扩增曲线，在一些其它志贺氏菌（如福氏志 贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌）和非志贺氏菌均未出现扩增曲线。内参照引物和探 针Ctrl-F/Ctrl-R/Ctrl-P(即由SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 11组成的引物对；探针的核 苷酸序列为SEQIDNo. 12所示）在所有细菌中均能够出现扩增曲线。
[0013]而引物和探针Son2-F/Son2-R/Son2-P(即由SEQIDNo. 4 和SEQIDNo. 5 组成的 引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo.6所示）、Son3-F/Son3-R/Son3-P(即由SEQID No. 7和SEQIDNo. 8组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo.9所示）以及内参照 引物和探针Ctr2-F/Ctr2-R/Ctr2-P(即由SEQIDNo. 13和SEQIDNo. 14组成的引物对； 探针的核苷酸序列为3￡〇10此.15所示）、(：壮34/(：壮3-1?/(：壮3-?(即由5￡〇10此.16和 SEQIDNo. 17组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 18所示）的实时荧光PCR特 异性不好。
[0014] 因此，本发明选择引物和探针Sonl-F/Sonl-R/Sonl-P(即由SEQIDNo. 1和SEQID No. 2组成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 3所示）用于鉴定宋内氏志贺氏菌，以 引物和探针Ctrl-F/Ctrl-R/Ctrl-P作为内参照（即由SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 11组 成的引物对；探针的核苷酸序列为SEQIDNo. 12所示）。
[0015] 本发明所述引物对及探针能够应用于鉴定宋内氏志贺氏菌。
[0016] 本发明进一步公开了一种针对wbgZ基因鉴定宋内氏志贺氏菌的实时荧光PCR方 法，包括以下步骤：（1)提取待检测样品的DNA; (2)以提取的DNA为模板，以所述引物对和 探针建立PCR反应体系，进行实时荧光PCR扩增；（3)如果实时荧光PCR扩增结果中出现S 型扩增曲线，则判定待检测样品中含有宋内氏志贺氏菌；如果实时荧光PCR扩增结果中没 有出现S型扩增曲线，则判定待检测样品中不含宋内氏志贺氏菌。
[0017] 所述PCR反应体系的总体积为 25uL，其中，FastStartUniversalProbeMaster 12. 5yL，lOpmol/yL上游引物 1. 0yL，lOpmol/yL下游引物 1. 0yL，lOpmol/yL探针 1. 0yL，20yg/mL的模板DNA2. 0yL，余量为灭菌蒸馏水。
[0018] 其中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNo. 1所示，所述下游引物的核苷酸序 列为SEQIDNo. 2所示，所述探针的核苷酸序列SEQIDNo. 3所示。所述探针的5'端标记 有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团；优选的，所述荧光报告基团为FAM荧光报告基 团，所述荧光淬灭基团为TAMRA荧光淬灭基团。
[0019] 所述实时荧光？0?扩增的条件为：95°0 31^11;951：变性3〇8,591：退火3〇8,40个循 环。另外，在扩增样品的同时，用内参照引物和探针进行扩增，内参照引物和探针Ctrl-F/Ctrl-R/Ctrl-P(即由SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 11组成的引物对；探针的核苷酸序列 为SEQIDNo. 12所示）的退火温度为57°C，其余扩增条件及PCR反应体系同引物和探针 Sonl-F/Sonl-R/Sonl-P。
[0020] 实时荧光PCR敏感性试验结果表明，将宋内氏志贺氏菌两步增菌后经PCR检测， PCR的最低检出限为1~3cfu/25g(mL)，证明本发明实时荧光PCR方法具有极高的敏感性。
[0021] 为了提高检测的灵敏性，本发明在实时荧光PCR检测前，采用了增菌步骤，其优点 在于：使损伤的细胞得以修复，使细胞的数量增加，稀释样品中的抑制剂及死细胞，从而避 免出现假阴性或假阳性，增加检测的灵敏度，提高检测的可靠性。本发明结果表明，经过增 菌之后，直接对增菌肉汤进行实时荧光PCR检测，在其它杂菌污染轻微的食品中，检测的灵 敏度可达1~3cfu/25g(mL