亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒及检测方法

文档序号:9246044阅读:1214来源:国知局
亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药试剂领域,尤其涉及基因诊断试剂盒,具体是指一种亚甲基四氢 叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)是一碳单位代谢酶,存在于动物肝脏。是叶 酸甲基化过程中的关键酶,其主要作用是可将5, 10-四氢甲基叶酸还原为5-甲基四氢叶 酸,为同型半胱氨酸转化为蛋氨酸提供甲基,并且是DNA、以一碳单位的形式参与嘌呤和嘧 啶的合成,并为DNA、RNA和蛋白质甲基化提供甲基,影响DNA代谢。
[0003] 蛋白质和神经传递因子等多种生物基质的甲基供体。甲硫氨酸为人体内的必需氨 基酸,甲硫氨酸合成受阻使蛋白质合成异常。作为甲基供体参与甲硫氨酸代谢,从而维持血 浆同型半胱氨酸(Hey)正常水平,Hey代谢途径如图1。MTHFR677C-T突变突变后,其生物 活性仅有正常酶活性的50%,并且其与血浆同型半胱氨酸升高有关。MTHFRC677T突变位 点是目前发现的MTHFR基因最常见的不耐热错义突变,研宄表明该突变导致MTHFR酶活性 下降使Hey甲基化障碍,导致Hey水平升高。
[0004] 1、MTHFR与相关疾病
[0005] 1. 1MTHFR与心血管疾病
[0006] 高同型半胱氨酸血症是心血管疾病危险因子。MTHFR是Hey代谢的关键酶,该基因 C677T在Hey代谢途径是最为常见的突变类型。C-T的突变使其活性和耐热性降低而引 起Hey血中水平升高,血浆Hey水平升高可直接或间接的损伤血管内皮细胞,使得ET-1合 成增加,N0及PGI2分泌减少,破坏血管舒、缩因子的平衡。搞Hey还可刺激血管平滑肌细 胞增殖,降低血管壁的顺应性,致血管壁弹性降低。因此Hey水平的升高参与了心血管的病 理生理过程。
[0007]MTHFR677C-T突变致心血管病的机理如下:1.内皮毒性的作用:MTHFR 677C-T突变导致Hey在体内水平升到,可引起内皮细胞损伤,破坏血管壁弹力层和胶原纤 维致血管弹性下降。机理可能是:a.Hey在细胞内发生自氧化,产生氧自由基,导致细胞结 构破坏和功能的改变;b.Hey降低细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的水平,消弱了其阻止N0氧 化失活的作用,增强了脂质过氧化物与过氧化氢对细胞损伤效应;c.改变内皮细胞基因表 达,诱导细胞凋亡。2.刺激血管平滑肌细胞增生:Hey促进血管平滑肌细胞增殖,血管顺应 性下降,促进动脉硬化的形成。3.对凝血功能的影响:Hey改变凝血因子含量和活性促进血 栓形成。Hey促进apoB自由胺基和LDL巯基化使LDL密度增加,Hey还参与炎症反应与免 疫反应,影响细胞发育和分化。
[0008] 1. 2MTHFR与非综合征性唇腭裂
[0009] 非综合征性唇腭裂是指不伴有任何其他发育畸形的唇腭裂,占所有唇腭裂发病 数量的70%。非综合征性唇腭裂在各种族的发病率有所不同,亚洲黄种人及美洲印第 安人群中最高,白种人次之,黑人发病率最低。在我国,非综合征性唇腭裂发病率大约为 1. 42/1000。叶酸是颁面部发育的必要因素,而MTHFR突变后可导致叶酸代谢过程中亚甲基 四氢叶酸还原酶功能的缺失使得叶酸浓度下降,从而增加胎儿罹患非综合征性唇腭裂的概 率。
[0010] 1. 3MTHFR与男性不育
[0011] Hey具有细胞毒性,可以使巯基氧化,细胞内产生大量氧自由基,导致精子线粒体 和核DNA损伤,最终引起精子功能受损。同时有研宄认为Hey可抑制谷胱甘肽合成,破坏精 液中活性氧产生与清除的动态平衡,影响精子功能。另有研宄表明,高Hey血症可引起睾丸 中的血管过早发生动脉硬化,影响睾丸的血液供应,导致生精功能障碍。叶酸是一种抗氧化 剂,当体内呈高Hey水平时,如果摄入叶酸减少,体内无足够的叶酸来抵制高Hey产生的氧 化应激,可致精子DNA受损,影响生育功能。
[0012] 1.4MTHFR与复发性自然流产、早产
[0013] 早产是常见的妊娠并发症,占分娩总数的5%~15%。约有15%的早产儿在新生 儿期死亡,占新生儿死亡的70%以上。存活的早产儿中10%~30%留有远期的智力发育障 碍或神经系统的后遗症。MTHFR突变会使Hey代谢受阻,在体内积聚引起高同型半管氨酸血 症。高同型半管氨酸血症与多发性流产、子痫前期、胎盘早剥、胎儿生长受限、胎儿畸形、死 胎有关,且与早产密切相关。在影响Hey代谢的关键酶中,MTHFR最为受到研宄重视。这是 由于MTHFR存在基因突变会降低酶的活性,是造成Hey浓度升高的重要遗传因素。
[0014] 导致复发性自然流产发生的机制有以下两个方面:1.妊娠期孕妇血液处于高凝 状态,胎盘部位血管网络内血栓的形成可导致流产、妊娠期高血压疾病等病理妊娠,因而凝 血机制在复发性自然流产中的作用机制备受关注。MTHFR是常见的凝血相关基因,677位 点的突变使酶活性降低,体内Hey水平升高,从而引发高Hey血症,引起胎盘栓塞,导致发生 复发性自然流产。2.MTHFR在叶酸代谢、甲基供体生成和核苷酸重新合成过程中起重要作 用。叶酸代谢异常可诱导DNA甲基化的模式发生畸变,进而将可能导致低效的DNA复制和修 复。由于突变使得体内叶酸缺乏,胎盘组织中的MTHFR活性下降,引起胎儿生长发育必须的 生物成分DNA出现甲基化不足,并且DNA合成和修复过程发生障碍,导致复发性自然流产。 MTHFR677CT和TT型孕妇发生复发性自然流产的危险性分别是CC型孕妇的8. 75倍和9. 33 倍。
[0015] 1.5MTHFR与高血压
[0016] 研宄表明在轻中度高血压人群中,血浆Hey与叶酸水平存在负相关,在血浆Hey转 化为蛋氨酸的途径中,是以5-甲基四氢叶酸为甲基供体,而5-甲基四氢叶酸又是由叶酸在 体内转化而成的,由此,患者体内的叶酸水平会明显影响着Hey的水平。研宄表明每日服 用叶酸l〇mg-年后,血浆Hey水平明显下降。而经观察高血压人群其平均血浆Hey水平 (15ymol/L)要比一般人群血浆Hey水平(10ym〇l/L)要高。高血压患者是心血管病变的 高危人群,同时血浆Hey水平明显高于正常人,而血浆Hey浓度升高,可破坏血管内皮,激活 血小板、凝血系统,抑制蛋白C等抗凝血物质的活性,导致血栓形成,增加心肌梗死、动脉粥 样硬化、冠心病、心脑血管病变的发生率。MTHFR677C-T突变后,Hey水平会显著增加, MTHFR带有TT基因型人群中Hey水平高于CT基因型,CT基因型高于CC基因型,说明TT基 因型中叶酸水平对血浆Hey水平的影响最大,如果TT基因型患者中叶酸缺乏,其血浆Hey 水平将最高;同样,如果TT基因型患者中在治疗高血压的同时补充叶酸,其血浆Hey的下降 幅度也将最大。一方面高血压患者中TT基因型者血浆Hey水平显著高于其他基因型患者, 另一方面,TT基因型患者中,补充叶酸降低血浆Hey水平的幅度高于其他基因型患者。 [0017] 妊娠期高血压疾病:MTHFR基因677位点的突变使酶活性降低,体内Hey水平升 高,当Hey水平升高时,容易被氧化成同型半胱氨酸化合物,同时产生过氧化氢和超氧离子 自由基,导致血管内皮细胞损伤和血管细胞增殖,由于内皮细胞长期暴露于较高水平的Hey 中,导致细胞释放一氧化氮产物减少,内皮细胞介导的抑制作用减弱,血小板黏附聚集,而 且Hey晶体可以为血管内凝血因子的接触活化过程提供"治病表面"。最终导致血管性疾病 影响子宫胎盘血流,最终导致妊娠期高血压疾病。
[0018] 1. 6MTHFR与神经管缺损
[0019]脊柱裂、无脑儿及脑脊膜膨出是一系列由于神经管未闭引起的新生儿出生缺陷。 其发病机制与遗传和环境因素等综合作用相关。在怀有神经管缺陷患儿的妇女血中有轻度 高半胱氨酸(Hey)水平上升的现象,且怀孕期间母体Hey浓度轻度升高或蛋氨酸浓度轻度 降低将会干扰神经管闭合。5, 10-亚甲基四氢叶酸在半胱氨酸的代谢中有非常重要的地位, 它催化5, 10-亚甲基四氢叶酸还原成5-亚甲基四氢叶酸,而后者将甲基转给高半胱氨酸使 其生成蛋氨酸。MTHFR的缺陷必将导致Hey向蛋氨酸的转化发生障碍,形成高半胱氨酸血 症,从而干扰神经管闭合而产生神经管缺陷。
[0020] 1. 7MTHFR与心脏缺陷
[0021] 在新生儿先天畸形中先天性心脏缺损是最常见的。先天性心脏缺损在新生儿中可 独立发生也可能与其他并发症同时发生,先天性心脏缺损中的冠心病已经被证实是由遗传 和环境因素共同决定引起的。有研宄证明孕妇可服用含叶酸的口服液来降低先天性心脏缺 损的发生,可降低约58%。由于叶酸对冠心病的抑制作用,因此叶酸的代谢便与冠心病息息 相关,作为叶酸代谢途径中的关键酶MTHFR在此途径中发挥着关键作用。MTHFR发生突变 后其酶活性将降低,导致叶酸代谢异常
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