阳离子双亲性膜靶向α-螺旋多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种阳离子双亲性膜靶向α -螺旋多肽的序列设计及其在细胞 不踪、癌症治疗等方面的应用。
【背景技术】
[0002] 生物质膜含有磷脂成分，因此具备了疏水的特性；相关研究表明癌细胞比正常细 胞的表面电位低，呈现更强的负电性；线粒体和细胞核，也维持着很强的内部负电位，因而 是阳离子多肽理想的选择性作用靶标。多肽分子具有很好的生物相容性，多功能性及结构 设计多样性高的优点而引起了研究者们的兴趣。阳离子双亲性多肽在癌症治疗领域的研 究也越来越多，比如爪蛙蟾素，蜂毒肽。但此类多肽多需由生物体中提取，其操作复杂，产量 低，难以进行规模化应用。
【发明内容】
[0003] 鉴于现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种阳离子双亲性膜靶向α -螺 旋多肽及其应用。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案： 一种阳离子双亲性膜靶向α-螺旋多肽，包含如下所示氨基酸序列JX1X2X3X 1X2X3X1]η-ΝΗ2，其中NH2分布于所述多肽的C端，X1为带正电荷的极性氨基酸，Χ 2、Χ3为非极性疏水性 氨基酸，并且Xp X2、X3均为L型氨基酸，η为正整数。
[0005] 进一步的，在遇到生物质膜时，所述多肽能够形成α -螺旋构象。
[0006] 进一步的，所述多肽具有SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 6中任一者所示氨基酸序列。
[0007] 如前任一项所述的阳离子双亲性膜靶向α-螺旋多肽在制备癌细胞检测试剂、抗 癌药物或抗癌药物前体、细胞内示踪试剂或细胞毒性试剂中的应用。
[0008] 以下进一步说明本发明的多肽的特点，其包括： 1)本发明的一系列阳离子双亲性膜靶向α -螺旋多肽易于与癌细胞发生作用，多肽遇 到生物质膜能够形成α -螺旋构象，能够增强与癌细胞的作用。
[0009] 2)本发明的多肽具有抗癌活性，不同类型的疏水氨基酸（L，I，F，A等）的膜作用效 果有明显不同，氨基酸序列亲疏水性的调节导致多肽在细胞水平定位的差异。多肽可定位 于细胞膜等细胞内的生物膜结构及细胞内的亚细胞器，比如线粒体、溶酶体等，但并不局限 于上述结构。
[0010] 3)本发明的多肽的细胞毒性与多肽的关键成胶束浓度（CMC)具有高度相关性，当 低于此浓度时细胞存活率不受影响而定位于溶酶体中，当高于此浓度时多肽可以自组装成 微胶束与细胞膜作用而产生强烈的细胞毒性。
[0011] 4)本发明的多肽序列N端含有一个组氨酸，能够与环金属铱配位化合物，例如， 分子式为（LCTN)2Ir (Ls0Iv)2M _发生配位反应，使得多肽具备绿色荧光，便于进行胞内示 足示。
[0012] 概言之，与现有技术相比，本发明的优点包括：提供了一系列阳离子双亲性膜靶向 α -螺旋多肽，其具有抗癌活性，不同类型的疏水氨基酸（L，I，F，A等）的膜作用效果有明显 不同，且在高于关键成胶束浓度时可以自组装成微胶束产生猛烈地细胞杀伤作用，为抗癌 药物的开发提供了新的依据。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明多肽杀伤细胞的作用机理示意图； 图2A和2B是实施例1-2中阳离子双亲性膜靶向α -螺旋多肽关键成胶束浓度变化曲 线图，其中图2Α是多肽序列2的关键成胶束浓度（CMC)变化曲线图，图2Β是多肽序列5的 关键成胶束浓度变化曲线图； 图3A和3B是实施例1中环金属铱配位化合物标记多肽序列2后，在关键成胶束浓度 上下多肽的细胞内定位图，图3A是在低于此浓度时多肽聚集于溶酶体的激光共聚焦图，图 3B是高于此浓度时多肽透过于细胞膜进入胞浆中导致细胞死亡的激光共聚焦图。
[0014] 图4A和4B是实施例2中环金属铱配位化合物标记多肽序列5后，在关键成胶束 浓度上、下多肽的细胞内定位图，图4A是在低于此浓度时多肽聚集于溶酶体的激光共聚焦 图，图4B是高于此浓度时多肽作用于细胞膜导致细胞打孔死亡的激光共聚焦图。
【具体实施方式】
[0015] 本发明的一个方面提供了一系列阳离子双亲性膜靶向α-螺旋多肽，其具有抗癌 活性，不同类型的疏水氨基酸（L，I，F，A等）的膜作用效果有明显不同，氨基酸序列亲疏水 性的调节导致多肽在细胞水平定位的差异。多肽的细胞毒性与关键成胶束浓度（CMC)存在 高度相关性，当低于此浓度时细胞存活率不受影响而定位于溶酶体中，当高于此浓度时多 肽可以自组装成微胶束与细胞作用而产生强烈的细胞毒性，为抗癌活性多肽的设计合成提 供了新的参考。
[0016] 参阅图1所示系本发明的多肽杀伤细胞的作用机理示意图。
[0017] 更为具体的，本发明的阳离子双亲性膜靶向α-螺旋多肽包含如下所示氨基酸序 列：[X1X2X3X1X2X 3X1L-NH2，其中NH2分布于所述多肽的C端(亦可理解为，NH 2表示C端氨基 化)，X1为相同的带正电荷的极性氨基酸，X2、X3为相同或不相同的非极性疏水性氨基酸，并 且Xi、X2、X3均为L型氨基酸，η为正整数。
[0018] 在一具体实施方案之中，所述带正电荷的极性氨基酸可采用Lys或Arg。
[0019] 进一步的，所述多肽遇到生物质膜能够形成α -螺旋构象。
[0020] 作为较为典型的实施案例，所述多肽可具有SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 6中任一 者所示氨基酸序列，即： 序列 I :hgg-(Klaklak)2-NH2序列 2 :hgg-(Rlarlar)2-Nh2序列 3 :hgg-(Kiikiik)2-NH2序列 4 :hgg-(Kllkllk)2-Nh2序列 5 :hgg-(Rllrllr)2-Nh2序列 6 :HGG-(KLLKLLK) 3-NH2。
[0021] 进一步的，所述多肽的细胞毒性随η的增大而增强。
[0022] 进一步的，当所述多肽的浓度低于关键成胶束浓度时，细胞存活率不受影响而定 位于溶酶体中，而当所述多肽的浓度高于关键成胶束浓度时，所述多肽自组装形成微胶束 并与细胞膜作用而产生强烈细胞毒性。
[0023] 本发明的另一方面提出了前述阳离子双亲性膜靶向α-螺旋多肽在制备癌细胞 检测试剂、抗癌药物或抗癌药物前体、细胞内示踪试剂或细胞毒性试剂中的应用。
[0024] 进一步的，本发明的多肽的氨基酸序列亲疏水性的调节导致多肽在细胞水平定位 的差异，例如，可定位于细胞膜等细胞内的生物膜结构及细胞内的亚细胞器，比如线粒体、 溶酶体等，但并不局限于上述结构。
[0025] 进一步的，多肽的细胞毒性与多肽的关键成胶束浓度（CMC)具有高度相关性，当低 于此浓度时细胞存活率不受影响而定位于溶酶体中，当高于此浓度时多肽可以自组装成微 胶束与细胞膜作用而产生强烈的细胞毒性。
[0026] 作为较为优选的实施方案之一，所述多肽序列N端含有一个组氨酸，能够与环金 属铱配位化合物（LCTN)2Ir (Ls0Iv)2 M _发生配位反应，使得多肽具备绿色荧光，便于进行 胞内示踪，为抗癌药物的开发提供了新的依据。
[0027] 例如，作为典型实施方案之一，本发明提供了一种胞内示踪试剂，其主要由前述阳 离子双亲性膜靶向α-螺旋多肽通过N端的一个以上组氨酸与环金属铱配位化合物通过配 位反应而形成，并具备绿色荧光，所述环金属配合物的结构式如下：
其中，I^n为C~N二齿配体，Lstjlv为溶剂分子，M _包括三氟甲基磺酸根、六氟磷酸根或 四氟硼酸根，所述C~N二齿配体包括2-苯基吡啶，1-苯基异喹啉，2-苯基苯并噻吩，苯并喹 啉，4-甲基苯基吡啶，4, 6-二氟苯基吡啶，2-(苯并噻吩）批啶，2-苯基喹啉或2, 5-二苯基 恶唑，且均不限于此。
[0028] 作为更为典型的实施案例之一，所述环金属配合物的分子式为[(Ppy)2Ir(H 2O)2] (OTf)。
[0029] 以下结合若干较佳实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的说明。
[0030] 实施例1 当X1SArg, X2SLeu, X3SAla时，多肽序列（SEQ ID No.2,亦可简称序列2)如下： HGG-(RLARLAR)2-NH2t5
[0031] 1.多肽的关键成胶束浓度实验 多肽的关键成胶束浓度实验中，多肽采用Milli Q水稀