杂交瘤细胞株4f2,其产生的单克隆抗体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及杂交瘤细胞株4F2、其产生的抗杀螟硫磷单克隆抗体及应用。
【背景技术】
[0002] 杀螟硫磷，又名杀螟松，属有机磷杀虫剂。毒性中等，对人畜低毒，大鼠急性经口 LD50为400-800mg/kg，大鼠急性经皮LD50为1200mg/kg。杀螟硫磷具触杀和胃毒作用，无 内吸和熏蒸作用，残效期中等，杀虫谱广，对鳞翅目幼虫有特效，也可防治半翅目、鞘翅目等 害虫。在农业生产中应用较广，对环境及人畜健康造成一定的威胁。因此对农产品中杀螟 硫磷的检测与监测具有一定的意义。
[0003] 目前，化学农药的残留检测多采用薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等方 法。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪 器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便 的现场检测要求。
[0004] 免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，便携而有利于进行现场监测，克 服了传统检测方法的缺点。已在医疗、食品等多个领域有较大的应用。本发明利用杀螟硫磷 免疫半抗原合成人工免疫原，免疫BALB/C小鼠后利用杂交瘤细胞技术筛选出可分泌高效 识别农药杀螟硫磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株4F2。通过酶标抗杀螟硫磷单克隆抗体建立 针对农产品中有机磷农药杀螟硫磷的高灵敏度免疫检测方法（ELISA):对杀螟硫磷的50% 抑制浓度（IC50)为0. 01ng/mL，与杀螟硫磷结构类似的农药如倍硫磷、甲基毒死蜱、三唑磷 等有机磷农药的交叉反应率均小于〇. 1%，针对杀螟硫磷在青菜、水和土壤中的添加回收率 在85% -100%之间，可用于有机磷农药杀螟硫磷残留的快速检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种可稳定分泌抗有机磷农药杀螟硫磷单克隆抗体的杂交 瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。
[0006] 本发明的另一目的是建立可用于农产品中杀螟硫磷残留快速检测的高灵敏免疫 检测方法。
[0007] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0008] 本发明提供提供了杂交瘤细胞株4F2,该细胞株已于2015年4月10日保藏于 中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201511。
[0009] 识别有机磷农药杀螟硫磷的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO. C201511的杂交 瘤细胞株4F2分泌产生。该抗杀螟硫磷单克隆抗体可以高效、特异性识别杀螟硫磷，对杀螟 硫磷的50%抑制浓度扣50为0.01叩/111匕
[0010] 本发明提供的杂交瘤细胞株4F2是通过将杀螟硫磷人工免疫原常规免疫BA1B/C 小鼠，利用杂交瘤细胞技术将效价最好的小鼠脾细胞与SP2/0进行融合，并利用ELISA方法 对获得的阳性克隆孔进行筛选，最终筛选出阳性值与竞争效果最好的孔，采用有限稀释法 进行亚克隆，克隆后再次进行筛选，如此反复筛选3-5次之后，最终筛选获得杂交瘤细胞株 4F2〇
[0011] 本发明提供的抗杀螟硫磷单克隆抗体来自于BALB/C小鼠腹腔。该小鼠经过液体 石蜡预处理后，注射杂交瘤细胞株4F2,并采集该小鼠的腹水，利用辛酸-硫酸铵法进行纯 化，收集得到抗杀螟硫磷单克隆抗体，并应用于杀螟硫磷的免疫检测方法的建立。
[0012] 本发明的有益效果在于：
[0013] (1)本发明提供的杂交瘤细胞株4F2可以分泌高效识别杀螟硫磷的单克隆抗体， 该抗体在酶联免疫吸附方法（ELISA)中测得的效价可达1.5X105。
[0014] (2)本发明提供的识别杀螟硫磷单克隆抗体灵敏度高、特异性好，在建立的免疫检 测方法中对杀螟硫磷的抑制中浓度IC50为0. 01ng/mL，与杀螟硫磷结构类似的农药如倍硫 磷、甲基毒死蜱、三唑磷等交叉反应均在0. 1 %以下。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 :杂交瘤细胞株4F2的筛选
[0016] 1.动物免疫
[0017] 将杀螟硫磷人工免疫原免疫6周龄的BA1B/C小鼠。第一次免疫将杀螟硫磷免疫 原与等体积的福氏完全佐剂乳化后，于小鼠腹腔注射。第二次免疫将杀螟硫磷免疫原与等 体积的福氏不完全佐剂乳化，注射方式与第一次免疫相同，间隔3周。第三、四、五次免疫分 别于第二次免疫程序一致，且间隔均为2周。从第3次免疫后，每次免疫后7-8天，小鼠尾 部静脉采血，分离血清，利用间接ELISA检测小鼠血清效价。最后一次免疫后，对血清进行 效价监测之外同时对血清灵敏度进行评价。选择效价、灵敏度均相对较高的血清所对应的 小鼠进行加强免疫，免疫剂量为前面的2倍，不加福氏佐剂，注射方式相同。
[0018] 杀螟硫磷人工免疫原为杀螟硫磷免疫半抗原与牛血清蛋白的偶合物，杀螟硫磷免 疫半抗原的分子结构为：
[0019]
[0020] 2.细胞融合
[0021] 最后一次加强免疫3天后取其脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通 过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37°C，5%二氧化碳培养箱培养10-12天后，通过检测融合 孔上清筛选杂交瘤细胞；
[0022] 3.杂交瘤筛选：
[0023] 用1000倍稀释的杀螟硫磷包被源包被酶标板，1 %明胶封闭，取杂交瘤细胞的培 养上清，采用非竞争间接ELISA法初步进行筛选，选取呈阳性的细胞孔，细胞上清留存用于 下一步检测，呈阴性的孔若重复一次后仍为阴性则可舍弃。
[0024] 对于上一步呈阳性的细胞孔则采用间接竞争ELISA法进行进一步的确认，间接竞 争ELISA法的具体操作如下：
[0025] (1)包被：用包被缓冲液（0. 05mol/L，pH9. 6)将包被抗原稀释1000倍加入酶标 板，每孔50yl，37°C温箱中孵育2h ;
[0026] (2)洗板：用洗涤液？851'(0.05%吐温20,0.01111〇1/1，？!17.4)洗涤5次，吸水纸拍 干；
[0027] (3)封闭：每孔加入120yL 0· 1%明胶，37°C孵育I. 5h ;
[0028] (4)洗板：同（2);
[0029] (5)加入杀螟硫磷和细胞上清混合物：每孔加入浓度为100 μ g/mL的农药溶平行 设置阳性对照和阴性对照；
[0030] (6)洗板：同（2);
[0031] (7)加入酶标二抗体：每孔加入50 μ L经1 : 20000倍PBST稀释的辣根过氧化物 酶-羊抗小鼠 IgG，37°C孵育Ih ;
[0032] (8)洗板：同（2);
[0033] (9)显色：每孔加入50 μ L新鲜配制的显色液，37°C温箱孵育IOmin ;
[0034] (10)终止：每孔加 25 μ L 2mol/L 的 H2SO4溶液；
[0035] (11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值；
[0036] 对农药杀螟硫磷出现明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗杀螟硫磷抗体的阳 性孔，阳性孔通过有限稀释法进行亚克隆，阳性孔分泌的上清即为所制备的杀螟硫磷单克 隆抗体。
[0037] 为获得大量抗杀螟硫磷单克隆抗体，本发明将获得的杂交瘤细胞株ALM2注射到 预先用无菌石蜡处理过的BALB/C小鼠腹腔，收集该小鼠的腹水，并利用辛酸-硫酸铵法进 行纯化后获得抗杀螟硫磷单克隆抗体。
[0038] 所获得的杂交瘤细胞株于2015年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（中 国，武汉，武汉大学），保藏编号：CCTCC N0:C201511，分类命名：杂交瘤细胞株4F2。
[0039] 实施例2 :抗体应用
[0040] 将上述获得的单克隆抗体应用于杀螟硫磷检测的酶联免疫方法的建立，并用于农 产品中杀螟硫磷含量的测定，其具体步骤如下：
[0041] (1)包被：用包被缓冲液（0. 05mol/L，pH9. 6)将包被抗原稀释1000倍加入酶标 板，每孔50yl，37°C温箱中孵育2h ;
[0042] (2)洗板：用洗涤液？851'(0.05%吐温20,0.01111〇1/1，？!17.4)洗涤5次，吸水纸拍 干；
[0043] (3)封闭：每孔加入120yL 0· 1%明胶，37°C孵育I. 5h ;
[0044] (4)洗板：同（2);
[0045] (5)加入杀螟硫磷和细胞上清混合物：每孔加入浓度为100 μ g/mL的农药溶液 (PBST稀释）25 μ L，再加入细胞上清25 μ L，37°C孵育lh，PBST洗涤5次，并平行设置阳性 对照和阴性对照；
[0046] 平行设置阳性对照和阴性对照；
[0047] (6)洗板：同（2);
[0048] (7)加入酶标二抗体：每孔加入50 μ L经1 : 20000倍PBST稀释的辣根过氧化物 酶-羊抗小鼠 IgG，37°C孵育Ih ;
[0049] (8)洗板：同（2);
[0050] (9)显色：每孔加入50 μ L新鲜配制的显色液，37°C温箱孵育IOmin ;
[0051] (10)终止：每孔加 25 μ L 2mol/L 的 H2SO4溶液；
[0052] (11)吸光度测定：用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值；
[0053] 用酶标仪测定450nm波长处的各孔吸光值，并计算抑制率。抗体的IC5tl= 0.0 lng/ HlLo
[0054] 实施例3 :上述ELISA检测方法的评价
[0055] 1.交叉反应的评价：通过评价该ELISA方法与系列有机磷农药的交叉反应来判断 该检测方法的特异性。选择待测的农药包括：倍硫磷、甲基毒死蜱、三唑磷等。以这些农药 为竞争物在该免疫电化学检测方法中获得的IC50值来计算该检测方法的交叉反应大小， 具体计算方式如下：
[0056] CR(%) = [IC5tl(杀螟硫磷）/IC5Q(受测竞争物）]X100,公式中，设定检测系统对 杀螟硫磷的交叉反应率为100%。
[0057] 2.准确性的评价：通过测试该检测方法对实际样品基质的抗干扰能力来判断该 体系的准确性。我们选择青菜、水和土壤作为检测对象。具体检测方法如下：
[0058] 将杀螟硫磷稀释成系列梯度的甲醇溶液，加入到相应的样品中。每克样品（青菜 叶片切割为细丝状）中加入ImL杀螟硫磷甲醇溶液。所有样品静止半小时，稳定后，提取样 品的上清液（水样中为混合液），并用PBST稀释20倍。将该稀释液加入到上述ELISA体系 中，并测定相应的回收率。
[0059] 经评价后，上述杀螟硫磷ELISA体系对与杀螟硫磷结构相近的有机磷农药，如倍 硫磷、甲基毒死蜱、三唑磷等的交叉反应率均在〇. 1%以内；在青菜、水和土壤中的添加回 收率为85% -100%。说明该免疫电化学检测方法对杀螟硫磷具有较好的选择性，在青菜、 土壤和水中的杀螟硫磷残留检测中具有较好的应用前景。
【主权项】
1. 一种用于检测有机磷类农药杀螟硫磷的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO : C201511的杂交瘤细胞株4F2产生。2. 产生权利要求1所述的用于检测检测有机磷类农药杀螟硫磷的单克隆抗体的杂交 瘤细胞株4F2,于2015年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO : C201511。3. 权利要求1所述的抗有机磷类农药杀螟硫磷单克隆抗体在农产品中杀螟硫磷含量 测定中的应用。
【专利摘要】本发明涉及用于检测有机磷农药杀螟硫磷的单克隆抗体及其应用。本发明提供的杂交瘤细胞株4F2可以用于制备高效识别杀螟硫磷的单克隆抗体，采用鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析法测得的效价为1.5×105。该抗杀螟硫磷单克隆抗体灵敏度高，对杀螟硫磷的50％抑制浓度(IC50)为0.01ng/mL，与杀螟硫磷结构类似的农药如倍硫磷、甲基毒死蜱、三唑磷等有机磷农药的交叉反应率均小于0.1％，可用于有机磷农药杀螟硫磷残留的快速检测。CCTCC NO：C20151120150410
【IPC分类】G01N33/577, C12N5/20, C12R1/91, C07K16/44
【公开号】CN104974257
【申请号】CN201510220766
【发明人】刘凤权, 王利民, 方庆奎, 蔡佳
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年4月28日