改性聚乙烯亚胺及其在制备基因转染载体试剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及聚合物改性领域，具体涉及一种改性聚乙烯亚胺及其在制备基因转染 载体试剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 基因转染技术是指将具备一定功能的外源核酸转运到靶细胞中，并在细胞中表 达，以获得预期目的，因此作为一种关键技术被广泛地应用基因治疗，农业生物技术，生物 制药工程等领域。将外源的基因导入生物细胞内需要借助基因转染载体，目前常用的载体 分为病毒载体和非病毒载体两大类。尽管病毒载体转染率尚，但其对外源基因的容纳量少 (约为4. 5~30kbp)、稳定性差，且病毒DNA在人体内有复制的可能，可诱导机体产生免疫 反应，存在致病致癌的风险，具有潜在的健康安全问题。非病毒载体包括阳离子聚合物和脂 质体等，脂质体虽然有较高的生物兼容性的优点，但其缺点在于其在体内不够稳定。
[0003] 目前研宄得较多的基因转导载体是阳离子聚合物，主要有聚乙烯亚胺 (polyethylenimine, PEI)、聚酰胺一酰亚胺（PAMAM)、壳聚糖、聚赖氨酸等。这些聚合物能与 基因有效地形成共价键，并对基因有一定的保护作用，从而避免外源基因被核酸酶降解。
[0004] 聚乙烯亚胺是一种水溶性高分子聚合物，其表面具有大量的正电荷，能够携带基 因穿透靶细胞的细胞膜，达到基因转运进靶细胞作用，具有稳定性高，成本低，转染率高的 优点，因此成为基因转染研宄中最广泛应用的非病毒载体材料之一。然而聚乙烯亚胺对细 胞的毒性较大，特别是高分子量聚乙烯亚胺，虽然具有很强的穿透细胞膜能力和很高基因 转染效率，但毒性更大，严重影响其在生物，医学和农业领域的应用。
[0005] 松香酸是一种天然的树脂酸，来源广泛，作为一种重要的工业原料，其具有生物相 容性高，成本低廉和一定的疏水性等特点。因此其应用范围极广，在表面活性剂，医药等均 有使用。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种改性聚乙烯亚 胺，该改性聚乙烯亚胺为一种松下酸（包括松香酸和脱氢松香酸）接枝聚乙烯亚胺的阳离 子聚合物，作为非病毒基因转染载体，能有效降低聚乙烯亚胺的细胞毒性，具有很高的生物 兼容性和基因转染能力，并且能形成稳定性高的纳米胶束。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述改性聚乙烯亚胺的制备方法。
[0008] 本发明的再一目的在于提供上述改性聚乙烯亚胺在制备基因转染载体试剂中的 应用。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0010] 一种改性聚乙烯亚胺，其结构如式I所示：
[0011]
[0012] 其中，所述的取代基R为
[0013] X、y分别代表重复单元数目，X为0~50000 ;y为0~50000 ;
[0014] 所述的改性聚乙烯亚胺主链聚乙烯亚胺的分子量优选为6000~40000 ;取代基R 的取代度优选为〇. 5%~20% ;
[0015] 所述的改性聚乙烯亚胺的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)将活化剂和松香酸或脱氢松香酸混合充分溶解于有机溶剂，在0~25°C反应 6 ~24h ;
[0017] (2)将聚乙烯亚胺充分溶解于有机溶剂后，将步骤（1)所制备的溶液滴入聚乙烯 亚胺溶液中，加入缩合剂和N，N-二异丙基乙基胺，并通氮气保护，在0~25 °C反应8~24h ; 反应完毕后，干燥，透析再干燥，得到改性聚乙烯亚胺；
[0018] 步骤（1)所述的活化剂优选为N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基硫代琥珀酰亚胺；
[0019] 步骤⑴所述的活化剂和松香酸或脱氢松香酸的摩尔比为（1. 2 :1)~（2 :1);
[0020] 步骤⑴所述的有机溶剂优选为四氢呋喃、甲醇和异丙醇中的至少一种；
[0021] 步骤（2)所述的聚乙烯亚胺分子量为6000~40000 ;
[0022] 步骤（2)所述的缩合剂优选为O-苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸；
[0023] 步骤（2)所述的聚乙烯亚胺与松香酸或脱氢松香酸的摩尔比为（1 :0. 01)~（1 : 0.5)；
[0024] 步骤（2)所述的聚乙烯亚胺与N，N-二异丙基乙基胺的摩尔比为（1 :0. 01)~（1 : 0.5)；
[0025] 步骤⑵所述的聚乙烯亚胺与缩合剂的摩尔比为（1 :0. 01)~（1 :0. 3);
[0026] 步骤⑵所述的有机溶剂优选为四氢呋喃、甲醇和异丙醇中的至少一种；
[0027] 上述方法制备得到的改性聚乙烯亚胺能够溶解于水，在水中形成稳定的纳米胶束 (粒径为20~400nm)，能够负载基因，实验数据表明对比聚乙烯亚胺，其保持具有较高的基 因转染能力，同时，对细胞的毒性显著降低，具有较高的生物安全性，可以应用于制备基因 转染载体，具有生物安全性高，转染效率高，成本低廉的特点。
[0028] 所述的改性聚乙烯亚胺在制备基因转染载体试剂中的应用；
[0029] 本发明的原理是：由于聚乙烯亚胺具有亲水性，本发明将具有疏水性的松香酸或 脱氢松香酸接枝到聚乙烯亚胺上，该改性聚乙烯亚胺能的疏水基团在水中由于分子间作用 力形成具有强大疏水性的致密的疏水核，亲水的聚乙烯亚胺则形成亲水外壳，从而形成具 有壳核结构的纳米胶束，和DNA结合后形成粒径很小的纳米粒。复合纳米粒子粒径变小后， 结构就会更加紧密，这样更容易穿过磷脂双分子层的细胞膜结构，从而能够提高转染效率。 聚乙烯亚胺改性的另一个目的是通过接枝侧链中和一部分正电荷，并形成胶束，降低暴露 在水中的表面积，从而减小聚乙烯的阳离子毒性。
[0030] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0031] (1)本发明制备的疏水基团接枝聚乙烯亚胺具有尺寸小的特点，可通过调节长松 香酸或脱氢松香酸的投料比来获得不同的疏水链接枝率从而调节疏水基团接枝羧甲基壳 聚糖的粒径大小。疏水基团接枝聚乙烯亚胺能够在水中形成稳定的胶束，增强其稳定性， 从而降低聚乙烯亚胺的细胞毒性，并且提高其基因转染能力，另外，其疏水内核具有载药潜 力：具有负载疏水性药物分子并紧密的包裹的潜力。
[0032] (2)本发明的改性聚乙烯亚胺的主要原料之一为松香酸或脱氢松香酸，其来源丰 富，成本低廉，为化工制药等工业广泛应用的原料之一。
[0033] (3)本发明的改性聚乙烯亚胺由于部分氨基被取代，能形成纳米胶束，从而降低细 胞毒性，并且提高了基因的转染能力。
[0034] (4)本发明的改性聚乙烯亚胺可作为一种安全高效的基因转染载体，也可以负载 药物，因此在基因治疗，农业生物技术（包括利用RNAi调控害虫免疫），生物制药工程和发 酵工程等领域有巨大的应用的价值。
【附图说明】
[0035] 图1是聚乙烯亚胺（分子量10000)转染细胞荧光表达结果分析图，其中，1~8代 表不同的DNA/聚乙烯亚胺质量比，1代表1 :1 ;2代表1 :2 ;3代表1 :1 ;4代表1 :4 ;5代表 1 :5 ;6 代表 1 :6 ;7 代表 1 :7 ;8 代表 1 :8。
[0036] 图2是改性聚乙烯亚胺样品1转染细胞荧光表达结果分析图，其中，1~8代表不 同的DNA/改性聚乙烯亚胺质量比，1代表1 :1 ;2代表1 :2 ;3代表1 :1 ;4代表1 :4 ;5代表 1 :5 ;6 代表 1 :6 ;7 代表 1 :7 ;8 代表 1 :8。
[0037] 图3是改性聚乙烯亚胺样品2转染细胞荧光表达结果分析图，其中，1~8代表不 同的DNA/改性聚乙烯亚胺质量比，1代表1 :1 ;2代表1 :2 ;3代表1 :1 ;4代表1 :4 ;5代表 1 :5 ;6 代表 1 :6 ;7 代表 1 :7 ;8 代表 1 :8。
[0038] 图4是改性聚乙烯亚胺样品3转染细胞荧光表达结果分析图，其中，1~8代表不 同的DNA/改性聚乙烯亚胺质量比，1代表1 :1 ;2代表1 :2 ;3代表1 :1 ;4代表1 :4 ;5代表 1 :5 ;6 代表 1 :6 ;7 代表 1 :7 ;8 代表 1 :8。
[0039] 图5是聚乙烯亚胺（分子量10000)/DNA的复合物凝胶电泳图，其中，泳道1为DNA/ 材料质量比为I :5 ;泳道2为DNA/材料质量比为I :4 ;泳道3为DNA/材料质量比为I :3 ;泳 道4为DNA/材料质量比为1 :2 ;泳道5为DNA/材料质量比为1 :1 ;泳道6为DNA/材料质 量比为2 :1 ;泳道7为DNA/材料质量比为3 :1 ;泳道8为质粒DNA ;泳道9为DNA marker。
[0040] 图6是改性聚乙烯亚胺样品2/DNA的复合物凝胶电泳图，其中，泳道1为DNA/材 料质量比为1 :5 ;泳道2为DNA/材料质量比为1 :4 ;泳道3为DNA/材料质量比为1 :3 ;泳 道4为DNA/材料质量比为1 :2 ;泳道5为DNA/材料质量比为1 :1 ;泳道6为DNA/材料质 量比为2 :1 ;泳道7为DNA/材料质量比为3 :1 ;泳道8为质粒DNA ;泳道9为DNA marker。
[0041] 图7是改性聚乙烯亚胺样品3/DNA的复合物凝胶电泳图，其中，泳道1为DNA/材 料质量比为1 :5 ;泳道2为DNA/材料质量比为1 :4 ;泳道3为DNA/材料质量比为1 :3 ;泳 道4为DNA/材料质量比为1 :2 ;泳道5为DNA/材料质量比为1 :1 ;泳道6为DNA/材料质 量比为2 :1 ;泳道7为DNA/材料质量比为3 :1 ;泳道8为质粒DNA ;泳道9为DNA marker。
[0042] 图8是聚乙烯亚胺与改性聚乙烯亚胺的毒性实验结果分析图，其中，（a):浓度分 另Ij 为 〇 μ g/200 μ L，0· 25 μ g/200 μ L，1 μ g/200 μ L，4 μ g/200 μ L，16 μ g/200 μ L 的聚乙烯 亚胺的毒性实验结果分析；(b):浓度分别为0 μ g/200 μ L，0. 25 μ g/200 μ L，1 μ g/200 μ L