一种防治杨树溃疡病的生防菌菌株及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及植物保护领域，尤其涉及一种防治杨树溃疡病的生防菌菌株及其应 用，具体地说涉及一种高效防治杨树溃疡病生防菌株黄绿木霉CGMCC8891及应用。 技术背景：
[0002] 作为人造板及纤维用材的重要加工原料，各品种杨树及其杂交品种在世界范围内 都有广泛的分布。此外，杨树对植树造林、生态恢复、风景绿化和防风固沙都有着重要的作 用。杨树容易感染多种病害，其中杨树溃疡病是我国杨树人工林重大生物灾害之一，严重制 约了杨树人工林的发展。这种病害主要是由葡萄座腔菌属（Botryosphaeria spp.)等真菌 引起的。杨树溃疡病可以造成杨树幼苗的死亡以及妨碍杨树的正常生长，严重影响杨树人 工林成材，制约我国林业、工业建设及生态恢复的稳定发展。该病在我国东北、华北、华东和 西北等地均普遍发生，造成育苗和造林的失败，经济和生态损失惊人，严重地区林木的发病 率高达96. 1%~100%，感病指数达6. 7%~95. 8%。
[0003] 目前对杨树溃疡病的防治主要通过加强抚育管理以及物理和化学方法来实现。但 化学防治对于环境的污染和破坏已成为不容忽视的问题。人们愈来愈关注自己的生存环 境，对病虫害的防治提出了越来越高的安全要求。随着社会经济的发展和人们环境保护意 识的增强，用生物防治的方法治理杨树溃疡病极有可能成为一种更为人接收的有效方法。
[0004] 从杨树组织中分离筛选获得对杨树溃疡病病菌具有拮抗作用的生防菌株，并将其 研制称为活菌制剂，对杨树溃疡病的防治具有重要的意义。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种高效防治杨树溃疡病的黄绿木霉菌株。该菌株于2014 年3月4日保存在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏编号为CGMCC8891。黄绿木霉CGMCC8891是一种从杨树组织中分离筛选获 得的对杨树溃疡病病菌具有拮抗作用的生防菌株，对杨树溃疡病的防治具有重要的意义。
[0006] 本发明另一个目的是提供所述高效防治杨树溃疡病的黄绿木霉CGMCC8891在防 治杨树溃疡病方面的多种应用。
[0007] 本发明的技术方案是提供一种高效防治杨树溃疡病的黄绿木霉CGMCC8891，在 PDA平板上，菌落初期为白色，后期在菌落中间有一圈明显的产孢区，颜色为深绿色、浅绿或 黄绿。菌丝有隔，分生孢子梗分枝多。孢子较小，球形，经常附着在菌丝周围。通过形态学 特征初步分析判定CGMCC8891菌株为绿霉属真菌。对菌株CGMCC8891的ITS基因序列进 行PCR扩增，产物纯化后测序。测得菌株CGMCC8891的序列长度为649bp。通过分析发现 CGMCC8891菌株与编号为HQ596956的黄绿木霉聚为一支，相似度为99%，亲缘关系最近， 同源性很高。综合菌株的形态学特征以及分子鉴定结果，确定CGMCC8891菌株为黄绿木霉 (Trichoderma aureoviride)。本发明所述高效防治杨树溃瘍病的黄绿木霉CGMCC8891通 过平板对峙试验、发酵液复筛及离体组织试验筛选获得。
[0008] 本发明还提供了所述高效防治杨树溃疡病的黄绿木霉CGMCC8891在防治杨树溃 疡病上的应用，并且可以用于制备防治植物病害的制剂。
[0009] 所述的防治杨树溃疡病的制剂的制备过程如下：
[0010] (1)先将菌株液体发酵：发酵条件为：接种量为3. 5%，装液量100mL/250mL，初始 pH值7. 0,温度34°C，转速190r/min，发酵时间96h ;发酵培养基为：土豆浸汁200g/1000mL， 果糖1%，牛肉浸粉1.4%，KC10. 1% ;
[0011] (2)固体发酵：选用50%玉米粉与50%麦麸混合作为固体发酵基质，发酵条件为 20%接种量，30%的含水量，培养温度为30°C。
[0012] (3)菌剂制备：将固体发酵物自然风干后碾碎制成原粉；添加38wt%原粉，38wt% 高岭土，13wt%木质素磺酸钠，8. 5wt% SDS，2. 5wt%腐植酸制成菌剂。
[0013] 所述的菌剂还可以经过稀释后，直接以喷洒和灌根的方式用于防治杨树溃疡病。 所述的菌剂稀释100~1000倍。
[0014] 本发明的有益效果是：
[0015] (1)黄绿木霉CGMCC8891对杨树溃疡病病原菌具有拮抗作用，而且具有对病原菌 的作用方式多种多样、繁殖速度快、作用效果稳定等优点，在杨树溃疡病生物防治中所起到 的作用非常重要；
[0016] (2)该种菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前 旦 -5^ 〇
【附图说明】：
[0017] 图1为黄绿木霉CGMCC8891菌株菌落形态图
[0018] 图2为黄绿木霉CGMCC8891菌株菌丝形态图
[0019] 图3为黄绿木霉CGMCC8891菌株对杨树溃疡病病原菌葡萄座腔菌的平板对峙拮抗 作用图
【具体实施方式】：
[0020] 本发明提供黄绿木霉CGMCC8891新菌株，其展现出对杨树溃疡病病原菌具有较强 的拮抗活性。
[0021] 本发明的新菌株分离自杨树干部组织。
[0022] 本发明的黄绿木霉CGMCC8891在PDA平板上，菌落初期为白色，后期在菌落中间有 一圈明显的产孢区，颜色为深绿色、浅绿或黄绿。菌丝有隔，分生孢子梗分枝多。孢子较小， 球形，经常附着在菌丝周围。通过形态学特征初步分析判定CGMCC8891菌株为绿霉属真 菌。对菌株CGMCC8891的ITS基因序列进行PCR扩增，产物纯化后测序。测得菌株CGMCC8891 的序列长度为649bp。通过分析发现CGMCC8891菌株与编号为HQ596956的黄绿木霉聚为一 支，相似度为99%，亲缘关系最近，同源性很高。综合菌株的形态学特征以及分子鉴定结果， 确定CGMCC8891菌株为黄绿木霉（Trichoderma aureoviride)。下面结合实施例对本发明 作进一步的详细说明，而不会限制本发明。
[0023] 实施例1杨树溃疡病内生生防菌的分离、筛选及鉴定
[0024] 分别采取杨树的叶片、枝条、干部组织以及因机械损伤后形成的愈伤组织，装入无 菌自封袋内，带回实验室至于4°C冰箱中保存，并尽快分离内生菌。通过培养特性和菌落特 征,判定从杨树组织中共分离微生物菌株115株，通过平板对峙实验，从115株菌中共分离 得到有抑菌效果的菌株71株，其中细菌和放线菌18株，真菌53株。综合"三明治"法和改 良琼脂扩散法对初筛菌株的发酵液进行复筛，结果筛选出YZ1B3、YYSB1、YZ2F10、CGMCC8891 和YYSF85株拮抗菌进行离体组织复筛。最终确定生防菌株CGMCC8891的拮抗作用最强。
[0025] 筛选到的菌株经过形态学观察，生理生化实验以及分子生物学鉴定，最终确定该 菌为黄绿木霉。
[0026] 本发明黄绿木霉CGMCC8891菌株菌落和菌丝形态图见图1和图2。
[0027] 实施例2黄绿木霉CGMCC8891菌株发酵工艺优化及稳定性
[0028] 经单因素实验、正交设计以及响应面分析，最终确定CGMCC8891的最优发酵培养 基和条件为：土豆浸汁200g/1000mL，果糖1%，牛肉浸粉1.4%，KC10. 1%，起始pH值7. 0， 温度34. 14°C，转速188. 80r/min，接种量3. 58%，装液量100mL/250mL，预测最优抑菌率 为85. 5667%。为了便于在实际生产中的操作和控制，将CGMCC8891的发酵条件调整为起 始pH值7. 0,温度34°C，转速190r/min，接种量3. 5%，装液量100mL/250mL。优化后菌株 CGMCC8891的抑菌率可达84. 98%，提高了生防菌株的抑菌活性，为菌株的后续开发利用提 供了保障。
[0029] 黄绿木霉CGMCC8891对酸碱处理有一定的耐受性，在pH为1的条件下，抑菌率为 63. 12%，在pH为12条件下，仍可保47. 34%的抑菌率，由此证明，黄绿木霉CGMCC8891在 酸性环境下仍能保持高的稳定性，在强酸性条件下有一定稳定性，而对高温条件的稳定性 较弱。实验证明，该菌株对紫外线不具稳定性。经传代10次后，该菌株的抑菌活性仍可达 73. 46 %，说明其遗传稳定。
[0030] 实施例3黄绿木霉CGMCC8891生防菌剂原粉的制备
[0031] 采用固体发酵方式制备菌剂原粉。设置3种不同固体发酵基质配方：I.固料400g， 其中碎米50%，麦麸50%，且固料与水的比例为I : 1(W/V)，II.固料400g，其中碎米50%， 玉米粉50%，且固料与水的比例为I : 1(W/V)，III.固料400g，其中麦麸50%，玉米面 50 %，且固料与水的比例为I : I (W/V)。结果表明选用50 %玉米粉与50 %麦麸混合作为固 体发酵基质最为适宜，抑菌率为88. 24%，活孢子数达1. 51 X 101(lCfu/g。
[0032] 固体发酵条件的筛选采用三因素三水平的正交设计，共设置9组实验。最终获得 CGMCC8891菌株适宜的固体发酵条件为20%接种量，30%的含水量，培养温度为30°C。在这 种条件下，抑菌率达90. 36 %，活菌数为8. 08 X IO9。
[0033] 将固体发酵物自然风干后碾碎制成原粉。
[0034] 实施例4黄绿木霉CGMCC889