一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的方法

文档序号:9258086阅读:445来源:国知局
一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于漆酶提取技术领域,具体涉及一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的 方法。
【背景技术】
[0002] 漆酶具有广泛的底物作用范围,可以氧化降解包括单酚、邻苯二酚、对二等多种酚 类化合物及其衍生物,也可以氧化降解一些不含酚羟基的酚类类似物,还可以氧化降解一 些有机磷毒物。因此,漆酶具有很多重要的生物学功能,尤其在纸浆生物漂白、废水处理、 环境污染物质去毒与降解方面显示出较大的研宄价值和应用潜力。而杏鲍菇是目前工厂 化生产主要品种之一,是我国工厂化第二大产量的食用菌产品,年产量达13万吨,杏鲍菇 (/7Zetfroiw1S 在栽培过程中菌丝通过产生大量的木质素降解酶系降解栽培料的木 质素及其纤维素,其中漆酶是木质素降解酶系关键酶之一,因此栽培后废弃菌袋中富含有 漆酶等多种胞外酶,工厂化栽培会产生大量的废菌包,废菌包来源稳定,为工厂化提取漆酶 生产提供了稳定原料来源,在市场上有着巨大的应用前景。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的在于提供一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的方法,旨在为漆酶 的应用提供更为科学的依据及低成本生产、稳定的来源。杏鲍菇废菌糠提取的漆酶在多环 芳烃生物修复方面有着广阔的应用前景。
[0004] 为实现上述目的,本发明采用如下技术方案: 一种利用杏鲍菇废菌糠制备固体漆酶的方法:将杏鲍菇废菌糠粉碎后,加入蒸馏水溶 解,在24°C,pH自然,110 rpm摇床振荡lh;4°C,8000 rpm离心15 min,取其上清液,采用 冷丙酮沉淀,50mM pH 6. 0的磷酸缓冲液溶解,DEAE-sepharose阴离子交换柱层析,收集50 mM pH 6.0磷酸缓冲液的洗脱液,冷冻干燥,得到固体漆酶。
[0005] 粉碎速率28000 r/min,粉碎时间30s。
[0006] 杏鲍菇废菌糠与蒸馏水的质量体积比为1 :10。
[0007] 离心后的上清液与丙酮的体积比为1 :1。
[0008] 制得的固体漆酶的酶活为10220U/L,酶分子量为44. 3kDa。
[0009] 本发明的显著优点在于:本发明旨在为漆酶的应用提供更为科学的依据及低成本 生产、稳定的来源。杏鲍菇废菌糠提取的漆酶在多环芳烃生物修复方面有着广阔的应用前 景。
【附图说明】
[0010] 图1是丙酮比例对漆酶沉淀率的影响。
[0011] 图2是DEAE-sepharose离子交换柱层析蛋白洗脱峰。
[0012] 图3是杏鲍菇漆酶的SDS-PAGE图,A为蛋白Marker ;B为纯化后的漆酶蛋白;C为 丙酮分级沉淀后的样品。
[0013] 图4是漆酶最适温度。
[0014] 图5是漆酶热稳定性。
[0015] 图6是漆酶最适反应pH。
[0016] 图7是漆酶pH稳定性。
【具体实施方式】
[0017] 1材料与方法 1. 1试剂 ABTS即2, 2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻挫啉-6-横酸),购于SouthernBiotech 公司,分析纯。其他试剂均为分析纯。
[0018] I·2 仪器 Adventurer?天平:AB204-E,奥豪斯国际贸易(上海)有限公司; 实验室超纯水设备:WP-UP-111-20,四川沃特尔水处理设备有限公司; 恒温振荡摇瓶柜:HYG-A,太仓市实验设备厂; 冷冻离心机:EppendorfCentrifuge5804R,上海富众生物科学有限公司; 恒温水浴箱:HS-6001,江苏省杰瑞尔电器有限公司; 微波炉:PJZIC-BI,美的微波电器制造有限公司; 真空冷冻干燥机:LGJ-10,北京松源华兴科技发展有限公司; 自动部份收集器:BS-100A-IXD,上海琪特分析仪器有限公司; 实验室pH计:STARTER3C,奥豪斯仪器(上海)有限公司; 紫外可见分光光度计:PHarmaciaBiotechultrospec2000 ; 双垂直电泳仪:DYCZ-24EN型,北京六一仪器厂。
[0019] 1. 3杏鲍菇采收后栽培料粗酶液的制备 将杏鲍菇采收后栽培料进行处理后,混匀,然后称取10 g,加蒸馏水定容至100 mL,在 24°C,pH自然,110 rpm的条件下,振荡,Ih ;4°C,8000rpm离心15min,取其上清液,即为粗酶 液,置于4°C冰箱保存备用。
[0020] 1. 4漆酶酶活的测定 以0. 2 mL的0.1 M ABTS为反应底物,在2. 7 mL的0. 1M、pH 4. 5醋酸-醋酸钠缓冲液 中加入0.1 mL样品,30°C反应3min。用紫外可见分光光度计测定420nm处吸光值的变化 (ε 42(ι=3· 6X lCT4mol/L · cm)。定义 Imin 氧化 1 μπιο? ABTS 所需的酶量为 1U。
[0021] 其中Δ OD为吸光值的变化量;△ t为反应时间;V总为体系总体积;V酶为样品体 积;ε 为 ABTS 的摩尔吸光系数(ε 42Q = 3· 6X IO4 mol / L · cm)。
[0022] 1.5蛋白浓度的测定 采用考马斯亮蓝方法,以牛血清蛋白为标准蛋白质作标准曲线。
[0023] L 6丙酮分级沉淀 向杏鲍菇粗酶液中添加-20°C预冷的丙酮,使冷丙酮比例分别为0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、 I. 0、2. 0、3. 0、4. 0,-20°C放置lh,期间震荡若干次,4°C,8000 rpm离心15min,弃上清,得到 的沉淀以pH 4. 5醋酸钠缓冲液溶解,测定漆酶酶活,以未处理粗酶液漆酶酶活为100%。
[0024] I. 7 DEAE-sepharose阴离子交换柱层析 丙酮二级沉淀以少量50mM pH 6.0的磷酸缓冲液溶解样品,得到的样品用于 DEAE-sepharose阴离子交换柱层析。层析柱预先使用50mM pH 6.0的磷酸缓冲液平衡至 核酸蛋白仪显示的OD值基线稳定。将样品上样于平衡好的离子交换柱,先以50mM pH 6.0 的磷酸缓冲液洗柱将未结合的蛋白洗脱下来直至收集到的样品在280nm处无吸收后,按 0~500mM NaCl的50mM pH 6. 0磷酸缓冲液进行梯度洗脱,控制洗脱速度lmL/min,每4min 收集一管样品记录A280变化并且测定漆酶酶活,取酶活最高的一管用冷冻干燥机来浓缩 样品。
[0025] 1.8 SDS-PAGE SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与考马斯亮蓝染色的详细实验步骤参考王家政、 范明主编的《蛋白技术手册》。分离胶浓度10%,浓缩胶浓度5%,以低分子量蛋白Marker为 标准,使用考马斯亮蓝R-250染色。表观分子量测定:以蛋白Marker为标准绘制1(^1111一迀 移率图,计算纯化漆酶蛋白表观分子量。
[0026] 1. 9最适反应温度和热稳定性 在30°0,40°0,50°0,60°0,70°0,80°0下测定漆酶酶活,以最高的漆酶酶活为100%,计 算其他温度下相对酶活。
[0027] 将漆酶样品置于30°C,40°C,
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