拟南芥糖基转移酶基因ugt76d1在减少植物表面蜡质中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种糖基转移酶基因的应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因 UGT76D1在减少植物表面蜡质中的应用，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 蜡质是植物表面一层疏水性保护层，常常包被在植物的叶片、茎杆表面。植物表面 蜡质由位于植物表皮的角质层外蜡和角质层内蜡构成。蜡质在不同的植物组成成分不同， 主要由特长链脂肪酸及其衍生物包括烷烃、初级和次级醇、醛、酮以及萜类和微量的次生代 谢产物如类黄酮等化合物组成（Pollard et al.，2008 ;Samuels et al.，2008 ;Li_Beisson et al. , 2013) 〇
[0003] 蜡质作为植物表面的疏水屏障，虽然在一定程度上能够减少水分散失、抵御病虫 害和防止紫外辐射，但同时也给农业生产带来了很多弊端。例如，植物表面蜡质影响了叶面 微肥的吸收效率，蜡质的存在影响了光的吸收、降低了光合效率，蔬菜茎叶表面的蜡质还能 影响口感、降低消化效率，另外，对于观赏植物而言，表面蜡质遮掩了植物本身的翠绿颜色， 影响了观感，等等。因此，如何减少植物表面蜡质，更好地满足农业生产的不同需求，也是目 前亟需解决的问题之一。然而，检索发现目前的转基因技术还没有找到一个很好的解决方 案。
[0004] 糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，拟南芥糖基转移酶家族1中 共有119个可能的糖基转移酶。虽然这些糖基转移酶基因的序列已公开于核酸序列数据 库中，但是这些糖基转移酶基因的特殊功能还远远没有被揭示，如拟南芥糖基转移酶家族1 中的UGT76D1基因能够创造出表面蜡质减少的转基因植物的功能和应用目前未见报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了 一种拟南芥糖基转移酶基因 UGT76D1在减少植物表面蜡质中的应用。
[0006] 本发明所述拟南芥糖基转移酶基因 UGT76D1在减少植物表面蜡质中的应用。
[0007] 其中：所述糖基转移酶基因 UGT76D1的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。所述植 物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、油菜、白菜、甘蓝或芥菜。
[0008] 本发明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从拟 南芥中克隆糖基转移酶基因 UGT76D1，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基 因操作，获得转基因植物。检测表明该转基因植物表面蜡质明显减少（见图1、图2、图3、图 4)〇
[0009] 本发明实施后可能带来的有益效果：
[0010] 实验证实，应用本发明所述糖基转移酶基因 UGT76D1进行植物转基因操作，可以 减少转基因植物的表面蜡质。这一新技术对于增强植物叶面微肥的吸收效率、增强光能吸 收和植物光合效率、增加产量、改善蔬菜在食用过程中的口感、增加观赏植物的翠绿颜色和 提高观感，都将带来有益效果，对于植物新品种开发生产具有重要意义。
【附图说明】
[0011] 图I. UGT76D1转基因植物表面蜡质减少的实物照片（证据之一）。
[0012] 其中WT为对照植物，OE-I和OE-2为两个UGT76D1转基因的过表达株系。对照植 物和过表达株系正常培养6周后，发现过表达株系均表现茎叶表面翠绿色，蜡质减少。
[0013] 图2. UGT76D1转基因植物表面蜡质减少的实物照片（证据之二）。
[0014] 叶片经过苯胺蓝染色以后，两个过表达株系更容易着色，进一步证明表面蜡质减 少，增加了染色剂的渗入。
[0015] 图3. UGT76D1转基因植物表面蜡质减少的实物照片------茎杆表面扫描电子显 微镜结果（证据之三）。
[0016] 其中WT为对照植物，OE-I和OE-2为两个过表达株系。实验材料是正常生长2周 的拟南芥对照植物和两个过表达株系。结果显示两株过表达系茎杆表面蜡质显著减少（表 面白色颗粒状结构）。
[0017] 图4.叶绿素提取率结果图（UGT76D1转基因植物表面蜡质减少的证据之四）。
[0018] 叶绿素提取实验，其中WT为对照植物，OE-I和0E-2为两个过表达株系。由叶绿 素提取率结果表明，由于表面蜡质的减少，两个过表达株系的叶绿素提取率明显高于对照。 阐明UGT76D1基因在减少蜡质方面具有新应用。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1克隆拟南芥糖基转移酶基因 UGT76D1
[0020] 1.拟南芥糖基转移酶基因 UGT76D1的克隆
[0021] 通过公开网站http://www. cazy. org获得UGT76D1基因的cDNA序列。根据cDNA序 列设计引物，正向引物为 76D1-F:5' -CGGGATCCATGGCAGAGATTCGCCAG-3'，反向引物为7601- R:5'-CGAGCTCTCATTGTTCGTCAATTTGCATC-3'。利用 TRIzol 试剂盒提取拟南芥RNA，RT-PCR方 法扩增UGT76D1基因的全长cDNA序列。将cDNA克隆的过程是先经过BamHI和Sac I酶切， 之后连入相应酶切的pBluescript II SK(+)载体中，构建成测序中间载体，称为pK76Dl，然 后用载体进行基因全长PCR扩增和BamHI和Sac I酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆 序列的正确性。
[0022] 2.拟南芥糖基转移酶基因 UGT76D1的序列信息与特性分析
[0023] UGT76D1基因的编码区cDNA为1359bp(核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示），编码 452个氨基酸（氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示）的57. 6kDa蛋白，C端具有44个氨基酸 的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。
[0024] 实施例2拟南芥糖基转移酶基因 UGT76D1的转基因应用
[0025] 1.含有UGT76D1编码区cDNA表达载体的构建
[0026] pK76Dl中间测序载体经过BamHI和Sac I双酶切后，获得带有酶切粘性末端的全 长cDNA序列。将此基因片段与用相应酶酶切后的pBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S 启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，称为PBI76D1。
[0027] 2.农杆菌介导植物转化
[0028] 农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的UGT76D1植物表达载 体（PBI76D1)转入农杆菌，然后进行PCR验证和酶切验证。利用浸花法（一种公开的常规 方法），使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后， 收集Tl代种子并在筛选培养基（MS培养基附加30mg/L卡那霉素）上进行筛选，将能够正 常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡那霉 素筛选，挑选出绿苗：白苗为3 :1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子（T3 代）。对每一单株的种子部分用于卡那霉素平皿筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株 系，即为纯合转基因株系。
[0029] 3.转基因植株分子鉴定
[0030] 对上述转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型 植株的RNA，反转录后进行RT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。 UGT76D1在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株。利用两个UGT76D1表达量高的 株系，即OE-I、OE-2,来进行后续的工作。
[0031] 4. UGT76D1基因减少植物表面蜡质功能验证
[0032] (1)UGT76D1转基因植物表面蜡质减少的证据之一。
[0033] 对照植物和过表达株系正常培养6周后，肉眼即可观察到过表达株系均表现茎叶 表面翠绿色，蜡质减少。见图1，其中WT为对照植物，OE-I和OE-2为两个UGT76D1转基因 的过表达株系。
[0034] (2)UGT76D1转基因植物表面蜡质减少的证据之二。
[0035] 叶片经过苯胺蓝染色以后，两个过表达株系更容易着色，进一步证明表面蜡质减 少，增加了染色剂的渗入。见图2。
[0036] (3)UGT76D1转基因植物表面蜡质减少的证据之三。
[0037] 茎杆表面进行扫描电子显微镜观察，实验材料是正常生长2周的拟南芥对照植物 和两个过表达株系。选取生长状态一致同高度茎段，扫描电子显微镜检测茎杆表面蜡质，结 果发现两株过表达系茎杆表面蜡质显著减少，见图3,蜡质为表面白色颗粒状结构，WT为对 照植物，OE-I和OE-2为两个过表达株系。
[0038] (4)UGT76D1转基因植物表面蜡质减少的证据之四。
[0039] 叶绿素提取实验，实验材料是正常生长2周的拟南芥对照植物和两个过表达株 系。选取生长状态一致的植株，剪取地上叶子，浸没于80 %的乙醇，每隔20min在647nm和 664nm处测定溶液的吸光度，计算叶绿素提取率。结果见图4,由于表面蜡质的减少，两个过 表达株系的叶绿素提取率明显高于对照。WT为对照植物，OE-I和0E-2为两个过表达株系。 再次证明UGT76D1基因在减少蜡质方面的新功用。
【主权项】
1. 拟南芥糖基转移酶基因UGI76D1在减少植物表面蜡质中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述糖基转移酶基因UGI76D1的核苷酸序 列如SEQ ID No. 1所示。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物是拟南芥、油菜、白菜、甘 蓝或芥菜。
【专利摘要】本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT76D1在减少植物蜡质中的应用，其中所述糖基转移酶基因UGT76D1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用基因UGT76D1构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明该转基因植物蜡质显著减少，预示本发明实施后将对增强植物叶面微肥的吸收效率、增强光能吸收和植物光合效率、增加产量、改善蔬菜在食用过程中的口感、增加观赏植物的翠绿颜色和提高观感，都将带来有益效果，对于植物新品种开发生产具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/54, C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN104975033
【申请号】CN201510319744
【发明人】侯丙凯, 黄戌戌, 李燕洁
【申请人】山东大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月11日