抗肿瘤药物生物标志物的筛选方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤治疗领域。具体地，涉及一种筛选抗肿瘤药物生物标志物的方法。
【背景技术】
[0002] 抗肿瘤药物的疗效主要由其基因组的异常表达决定，因肿瘤基因组的不稳定性及 肿瘤间的异质性，抗肿瘤药物往往仅在某一群病人身上有效。例如靶向BCR-Abl的格列卫 在BCR-ABL融合表达的慢性粒细胞白血病病人中五年生存率可达90%以上，靶向EGFR的易 瑞沙成功用于EGFR突变的非小细胞肺癌，ALK抑制剂Crizotinib也仅批准用于ALK阳性 的病人。在生物标志物如BCR-ABL的融合，EGFR突变，ALK融合的指征下，可以有效地判断 出"有效人群"和"无效人群"，从而提高疗效、降低毒副作用。2011年8月美国FDA出台文 件，建议申请新药临床研究时，同时提交选择敏感病人的分子诊断试剂盒，目前正在审批的 候选药物中，25%附有个体化药物特征的生物标志物。然而，仍有大量的抗肿瘤药物未寻找 到用来有效指征预测其疗效的生物标志物。如能在药物开发早期体外阶段筛选出其生物标 志物，可以大大降低整个药物开发的成本，加速药物的上市及临床应用。
[0003] 目前，筛选生物标志物主要有效手段是基于体外病人来源的肿瘤细胞系，如NCI60 (The US National Cancer Institute60)细胞系平台、CMT1000 (Center for Molecular Therapeutics)细胞系平台，CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)细胞系平台等，通过 关联药物反应与细胞基因组差异表达，分析二者相关性来寻找可特异性预测药物反应的标 志物。而在此类研究开展时，面临的一大问题是对同一种药物敏感性不同的细胞中，基因组 上往往也存在着大量的差异，这些差异中有些可能与药物反应相关，然而更多的则是与药 物反应不相关的差异，这些差异给相关性分析带来了无法消除的噪音，使得标志物分析变 得困难。此外，现有商用的细胞系很多都是全世界实验室相互多次交换使用，基本上不记录 代数，代数不明确。而且也有多篇研究报道这些商用细胞系已有大量相互之间交叉污染。
[0004] 因此，本领域迫切需要开发一种能够高效、准确甄别药物反应相关标志物的方法， 从而降低抗肿瘤药物生物标志物分析的难度和成本。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种来自单个病人的肿瘤细胞系集合，其不同细胞系间基因组差异 小，大大降低了噪音的影响，提高了甄别出药物反应相关标志物的效率和能力。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种筛选抗肿瘤药物生物标志物的方法，包括步骤：
[0007] (a)提供肿瘤细胞作为起始细胞，其中所述的肿瘤细胞是来自相同对象的相同肿 瘤组织；
[0008] (b)对所述的起始细胞进行传代和建系，并对获得的细胞系进行细胞特征信息检 测，从而获得至少5株存在细胞特征差异且基因组高度同源的肿瘤细胞系；
[0009] (C)对（b)中获得的肿瘤细胞系，进行抗肿瘤药物敏感性测试，并基于对所述抗肿 瘤药物的敏感性对所述肿瘤细胞系进行分型；和
[0010] (d)基于分型结果，对所述肿瘤细胞系的细胞特征信息进行分析，从而确定与所述 抗肿瘤药物敏感性相关的差异性标志物，所得的差异性标志物即所述抗肿瘤药物生物标志 物。
[0011] 在一个优选例中，所述的细胞特征信息包括：
[0012] 1)人类基因组DNA或RNA的序列、高级结构、以及修饰；
[0013] 2)蛋白质序列、结构、以及修饰；
[0014] 3)生物大分子的相互作用信息，包括物理及化学层面作用；
[0015] 4)细胞代谢物相关信息；
[0016] 5)生物图像信息等。
[0017] 在另一优选例中，所述细胞特征信息检测是基因组信息检测；和/或
[0018] 所述细胞特征差异是基因组差异。
[0019] 在另一优选例中，在步骤（b)中，获得5-1000株；较佳地10-500株，更佳地， 20-100株所述的肿瘤细胞系。
[0020] 在另一优选例中，步骤（c)中用于药物敏感性测试的肿瘤细胞系传代代数小于以 起始细胞系起算的50代，较佳地，小于20代，更佳地，小于10代。
[0021] 在另一优选例中，所述的差异性标志物包括某一基因或基因区域，或其编码蛋白。
[0022] 在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物生物标志物包括：
[0023] (1)导致肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感度上升的标志物；
[0024] (2)导致肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感度下降的标志物。
[0025] 在另一优选例中，所述的细胞特征差异包括：单个或多个基因甲基化水平的差异、 单个或多个基因组区域甲基化水平的差异。
[0026] 在另一优选例中，所述的基因组差异包括：单个或多个基因的差异(缺失、突变或 插入)、单个或多个基因组区域的差异。
[0027] 在另一优选例中，所述的基因组差异由任意两株细胞之间的差异性距离（d)表 /Jn 〇
[0028] 在另一优选例中，所述的差异性距离包括（但不限于）皮尔逊距离、欧氏距离、曼 哈顿距离、切比雪夫距离、闵可夫斯基距离、标准化欧氏距离、马氏距离、夹角余弦、汉明距 离、杰卡德距离、信息熵等。
[0029] 在另一优选例中，当差异性距离为皮尔逊距离时，OPP组中任意两株细胞的平均差 异性距离d>0,且显著小于CCLE组内任意两株细胞的平均距离（P〈0. 05)。
[0030] 在另一优选例中，所述的差异性距离d满足0 < d彡0. 9,较佳地，0 < d彡0. 6,更 佳地，0 < d彡0· 3。
[0031] 在另一优选例中，所述高度同源指任何2种肿瘤细胞系之间的基因组相同性 彡80%，较佳地彡90%，更佳地彡95%，最佳地彡99%，且所述的同源性< 100%。
[0032] 在另一优选例中，所述的分型包括将所述肿瘤细胞划分为选自下组的类型：
[0033] (i)敏感型，所述敏感型肿瘤细胞系的药物敏感性与对照细胞相比显著上升； [0034] (ii)普通型，所述敏感型肿瘤细胞系的药物敏感性与对照细胞相比无显著差异； 在有些实施例中普通型也称为中度敏感型；
[0035] (iii)耐药型，所述耐药型肿瘤细胞系的药物敏感性与对照细胞相比显著下降。
[0036] 在另一优选例中，所述的药物敏感性用下式所示敏感度差异值D表示：
[0037] D = A0/A1
[0038] 式中，
[0039] AO是所述测试物对所述对照细胞的生长产生50%抑制时的浓度；
[0040] Al是所述测试物对某一肿瘤细胞系的生长产生50%抑制时的浓度。
[0041] 在另一优选例中，对敏感型而言，所述的"显著上升"指与对照细胞相比，敏感度差 异值D彡2,较佳地D彡5,更佳地D彡8,最佳地D彡10。
[0042] 在另一优选例中，对普通型而言，敏感度差异值D满足0. 5 < D < 2,较佳地0. 75 < D < 1. 5。
[0043] 在另一优选例中，对耐药型而言，所述的"显著下降"指与对照细胞相比，敏感度差 异值D彡1/2,较佳地D彡1/5,更佳地D彡1/8,最佳地D彡1/10。
[0044] 在另一优选例中，所述的对照细胞包括一种或多种来源于不同对象的同类型的肿 瘤细胞。
[0045] 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞系还具有选自下组的一个或多个特征：
[0046] (1)细胞代数明确；
[0047] (2)基因组信息保留患者本身的基因组特征。
[0048] 在另一优选例中，所述的肿瘤组织细胞包括来自实体肿瘤或非实体肿瘤的细胞。
[0049] 在另一优选例中，所述的肿瘤包括：皮肤癌，白血病，肾上腺皮质癌，胆管癌，膀胱 癌，骨癌，脑癌，乳腺癌，气管及支气管肿瘤，淋巴瘤，神经系统肿瘤，宫颈癌，肠癌，肛门癌， 子宫内膜癌、食管癌，鼻咽癌，卵巢癌，肉瘤，眼癌，恶性纤维组织细胞癌，胆囊癌，胃癌，结直 肠癌、胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，胚细胞瘤，头颈癌，肝癌，下咽癌，黑色素瘤，胰腺癌，肾 癌，喉癌，唇癌，□腔癌，□咽癌，肺癌，间皮瘤，骨髓瘤，甲状旁腺癌，阴莖癌，嗜络细胞瘤，垂 体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，涎腺癌，皮肤癌，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，尿道 癌，阴道癌，外阴癌。
[0050] 在另一优选例中，所述的肿瘤组织细胞来自肝癌细胞。
[0051] 在另一优选例中，所述的相同肿瘤组织包括相同病理分型来源的原位肿瘤组织、 转移肿瘤组织(包括腹水中的肿瘤组织或细胞)。
[0052] 在另一优选例中，所述建系方法包括以下步骤：
[0053] (i)分离肿瘤组织并剪碎平铺于培养器皿中，并加入培养液培养5-10天，从而获 得粗培养体系；
[0054] (ii)去除（i)中的粗培养体系中的成纤维细胞，获得所述的肿瘤细胞即建系获得 的细胞系。
[0055] 在另一优选例中，所述建系方法还可以包括：将分离得到的肿瘤组织划分为不同 区域，对每个区域进行取样并分别放入不同的培养器皿中培养获得肿瘤细胞系。
[0056] 在另一优选例中，所述肿瘤细胞具备持续生长与传代能力。
[0057] 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞系还可以通过人工突变技术形成肿瘤细胞亚 系。
[0058] 在另一优选例中，所述的基因组信息检测包括：外显子检测、基因表达谱检测、 CNVs检测、全基因组测序、或其组合。
[0059] 在另一优选例中，所述的步骤（d)还包括基于分型结果，对所述肿瘤细胞系的细 胞特征信息进行分析，其中，所述的细胞特征信息包括：
[0060] 1)人类基因组DNA或RNA的序列、高级结构、以及修饰；
[0061] 2)蛋白质序列、结构、以及修饰；
[0062] 3)生物大分子的相互作用信息，包括物理(无化学变化)及化学(有化学变化)层面 作用；
[0063] 4)细胞代谢物相关信息；
[0064] 5)生物图像信息等。
[0065] 在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物包括目前经过FDA批准的所有抗肿瘤药。
[0066] 在另一优选例中，所述的抗肿瘤药包括经FDA批准的药物或未批准的药物。
[0067] 在另一优选例中，所述的抗肿瘤药包括已知靶向抗肿瘤药与未知靶向抗肿瘤药。
[0068] 在另一优选例中，所述的抗肿瘤药还包括任意的化疗药或化合物。
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