一种丁烷氧化菌丰度的自动化检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及油气和水合物勘探与油气和水合物藏表征技术领域，更具体地，涉及 一种丁烷氧化菌丰度的自动化检测方法。
【背景技术】
[0002] 中国是一个能源消耗大国。2013年我国石油的对外依存度接近60%。随着工业 化和城镇化进程的加快，我国对油气与水合物能源的需求进入持续增长期。我国虽然正在 实施节能减排和新能源发展战略，但是在相当长时期内我国仍然无法摆脱对油气资源的依 赖，因此我国能源安全已被提上重要日程。为缓解我国能源紧张局面，加大力度勘探和更加 高效地开发油气与水合物迫在眉睫，而高效的勘探方法及其配套装备的是解决能源需求的 关键途径之一。
[0003] 油气和水合物勘探领域包含地质勘探、地球物理勘探、地球化学勘探和微生物勘 探四大核心技术。其中前三种勘探技术相对微生物油气与水合物勘探技术而言已趋于成 熟。微生物勘探属油气和天然气水合物勘探领域四大核心技术之一，是依据地表土壤/沉 积物/水中微生物异常进行能源潜力评价的重要方法。微生物勘探技术因其快速、经济、结 果易解释等优势而倍受学界的关注。微生物勘探方法具有快速、经济和结果易解释等优势。 然而，因土壤、沉积物和水体中99%以上微生物不可培养，故基于培养法而建立的传统微生 物勘探方法在检测精度上很难满足勘探要求；因气态烃微渗漏是动态和不连续的，故传统 微生物勘探方法无法在微裂隙处于挤压状态的区块发现气态烃微渗漏；采用单一的活菌异 常指标难以在现今沙漠、戈壁和海洋深水等环境开展勘探；传统微生物勘探方法用于油气 藏表征时需两次采样，这不仅显著增加成本，且在很多开采区无法实施，因我国多数油气藏 未开展过微生物表征。
[0004] 微生物油气与水合物勘探技术的不成熟性主要表现在：（1)面对丰度很低、对油 气与水合物具有指示意义的、专性或兼性微生物的复杂样品，基于微生物培养法而建立的 传统微生物油气与水合物勘探技术，不仅很难测准其微生物丰度（因为土壤和沉积物中 99%以上的微生物不可培养），数据可靠性差；（2)无法发现微裂隙处于挤压状态的勘探区 油气与水合物藏；（3)面对复杂多样的油气与水合物勘探区，特别是沙漠、戈壁、盐碱地和 海洋深水区，基于微生物培养法而建立的传统微生物油气与水合物勘探技术基本失效；宄 其原因，主要是传统微生物油气与水合物勘探技术仅依赖于单指标的活菌异常；(4)基于 培养法的传统油气与水合物勘探技术对样品的处理效率非常低，通常一批样品至少需要14 天才能获得结果，周期长，效率低，成本高；（5)数据影响因素多、波动大，在分析测定流程 中会引入大量的人为误差；检测流程不可追溯，且无法进行系统误差的校正。
[0005] 王江海等基于微生物单细胞和基因的原态检测技术，率先提出原态微生物油气与 水合物勘探技术的概念、原理和技术方案，并在甲烷氧化菌活菌体外特异性荧光染色、甲 烷-丁烷氧化菌死菌和活菌的快速定量检测、微生物油气与水合物勘探多重指标的设立和 油气与水合物田区微生物群落变性梯度凝胶电泳分析的PCR策略等方面取得重要进展，形 成以气态烃氧化菌及其关联菌类的活菌、死菌和总菌异常为多重勘探指标的微生物油气与 水合物勘探技术，但目前仍然需要用手工方法检测微生物丰度，无法根本性解决微生物油 气与水合物勘探技术的缺陷。
[0006] 原态微生物油气与水合物勘探技术（IsMOST)是基于现代分子生物学技术的油气 与水合物勘探技术，只有实现低丰度微生物样品的大批量快速处理，以及在配套装备技术 领域取得根本性的突破的基础上，才有可能真正将原态微生物勘探技术运用于油气和水合 物勘探方面。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的一个技术问题是针对现有微生物油气与水合物勘探技术的不足， 尤其是自动化处理技术不足，提供一种丁烷氧化菌丰度的自动化处理方法，基于所述方法 可以实现低丰度微生物样品的大批量快速处理和分析，并保证准确的检测分析结果，实现 检测流程的可追溯性，可进行系统误差的统一校正。
[0008] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
[0009] 提供一种丁烷氧化菌丰度的自动化处理方法，包括以下步骤：
[0010] SI.构建原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站（isMOST);所述工作 站包括自动液体处理装置、核酸提取与纯化设备、PCR反应体系配置系统；
[0011] S2.样品处理，每个样品得到大于I. 5ml的上清液；
[0012] S3.采用本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站自动液体处理装置（isMOST Station 1)完成移液；具体是执行自动液体处理装置设定的程序，将不同的试剂通过自动 控制机械臂上移液通道和移液模块的操作自动加入对应的样品板、结合板、洗涤板和洗脱 板中；
[0013] S4.自动核酸提取仪提取与纯化DNA，将所有的样品板都准备好后，执行本发明原 态微生物油气与水合物勘探工作站（isMOST Station 2)设定的程序，即可得土壤和/或沉 积物中的总基因组DNA。约1小时后，核酸提取与纯化流程结束，将样品的核酸提取液移转 移至微量PCR管中，标记清楚后于-20°C冰箱中保存；
[0014] S5.琼脂糖电泳检测；
[0015] 操作方法如下：
[0016] L取5 μ I DNA提取液于1 %琼脂糖上电泳鉴定，DNA Ladder为DL2000。
[0017] 2.若有>2kbp条带，则取5 μ I DNA提取液加灭菌水稀释20倍后作为PCR模板并 在4 °C下保存，样品基因组DNA提取液保存于-20 °C。
[0018] S6. 丁烷氧化菌丰度的荧光定量PCR检测
[0019] (1) 丁烷氧化菌的培养
[0020] 配制丁烷氧化菌的培养基；将1 % 丁烷氧化菌接种于培养瓶中；密封后注入丁烷； 在适宜的温度下培养15天，尔后转接培养，至肉眼可见培养液浑浊；收集培养所得的丁烷 氧化菌菌体，用于丁烷氧化菌的核酸提取及标准曲线的绘制。
[0021] (2)设计特异性引物
[0022] 根据丁烷氧化菌bmoX基因的CDS序列，设计并合成可用于荧光定量PCR检测丁烷 氧化菌的两对特异性引物，引物序列如下：
[0023] 第一对引物：
[0024] bmoX-F:5'TCGCCCGAGCAGCGGAACGGTTATCT 3'
[0025] bmoX-R:5' AGGATTTTCATTGGATCAGGAATAGTAA 3'
[0026] 扩增得到的PCR产物长度为1190bp。
[0027] 第二对引物：
[0028] bmoX-DF:5'TGGCACCGGTGGGTGTACGAAGACT 3'
[0029] bmoX-DR:5，GCGCGATCAG(C:G 3:2)GTCTT(G:C 9:1)CC(G:A 1:9)TC 3，
[0030] 扩增得到的PCR产物长度约为400bp。
[0031] (3)制备标准品
[0032] 以总基因组DNA为模板，采用特异性引物扩增丁烷氧化菌的目标片段，且将其与 T载体连接；将连接产物加至感受态细胞悬液中，再提取质粒；经测序证实为丁烷氧化菌目 标片段后，再测定质粒DNA的纯度并定量；最后用无菌双蒸水稀释至一定浓度，-20°C分装 保存，作为荧光定量PCR的标准品。
[0033] (4)建立实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件
[0034] RT-PCR 扩增在 Roche Light Cycler 480 (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)中完成。反应体系是根据 SYBR? Premix Ex Taq?(TaKaRa)制造商说明书制备。两对引物 A189F and mb661R，955F25_butane and 1517R22,扩增丁烷氧化菌bmoX基因的⑶S序列。沉积物中总基因 DNA以1~IOng的水平 作为模板加入每个反应混合物中。按如下列出的参数配制PCR反应体系。
[0035] 实时荧光定量PCR反应体系：
[0036]
[0037] 实时荧光定量PCR反应条件
[0038]
[0039] 其中，PCR反应体系的配制在本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站（isMOST Station 1)中完成。操作流程如下：
[0040] SI 1.按照表2配制好反应体系混合液（除了 2 μ L DNA模板），分装于2ml灭菌离 心