重组系统的制作方法
【专利说明】重组系统 发明领域
[0001] 本发明涉及在靶位点进行重组的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 不同的细胞类型可以用于不同的工业目的。例如哺乳动物细胞系用于抗体生产； 真菌细胞是生产多肽和次级代谢物的优选生物；细菌细胞优选用于小的代谢物和抗体的生 产；植物细胞优选用于口味和风味化合物。
[0004] 重组技术广泛用于这样的细胞和/或使用这样的细胞的方法的生产力的最优 化。这可涉及大量的选择，包括但是不限于过表达感兴趣的基因，竞争途径的缺失或失 活，改变酶的区室化（compartmentalization)，增加蛋白或代谢物分泌，增加细胞器含量 (organelle content)等。
[0005] 就丝状真菌而言，可获得的可选择标记有限使新细胞系的构建复杂化。典型地，靶 序列在体外被改变以产生带有插入的抗生素抗性标记的突变等位基因。然而，鉴于大规模 使用携带抗性基因的生产菌株将这种基因扩散到生物圈的潜在风险，大多数国家的监管机 构反对使用抗生素抗性标记。此外，适用于丝状真菌的可选择标记数量有限。因此，可需要 除去可选择标记基因以使生产菌株可以在商业上使用和/或以使同样的标记基因可以在 连续的菌株修饰中再循环利用。
[0006] 发明概沐
[0007] 本发明涉及在例如革巴基因组内在革巴位点（target locus)或多个革巴位点（target loci)进行重组的方法。本发明所述的重组方法导致靶位点的改变，例如在靶位点插入核酸 序列。可实施所述的方法以使在靶位点插入新的序列并伴随从靶位点除去现存的序列。也 就是说，所述方法可被用于将靶位点上的序列替换为替代性序列。所述方法可方便地在宿 主细胞体内实施。
[0008] 典型地，当在体内实施时，不对人类或动物细胞实施本发明所述的方法。也就是 说，典型地不以治疗方法的形式实施本发明所述的方法。可以离体或体外方式实施本发明 所述的方法。术语离体或体外应被理解为包括对微生物（对完整活细胞或非细胞物质二 者）实施的方法，但排除对人类或动物实施的方法。
[0009] 典型地，实施所述方法使至少部分插入在靶位点的序列随后被移除。如果实施所 述的方法以在靶位点替换序列并随后移除插入的序列，那么结果可以是使靶位点的序列缺 失。
[0010] 因此，可实施本发明所述的方法以改变靶位点的序列。这种改变可以是，例如添加 新的序列、置换现存的序列和/或缺失/去除现存的序列。
[0011] 典型地，本发明在宿主细胞体内进行。宿主细胞可以优选地是生产感兴趣的化合 物的细胞。宿主细胞可以在应用本发明方法之前能够生产感兴趣的化合物。在这种情况下， 本发明的方法可以用于修饰靶位点以使通过宿主细胞的感兴趣的化合物的生产改变，例如 可以增加产量。或者，宿主细胞可以是由于应用本发明的方法而生产感兴趣的化合物的细 胞。
[0012] 因此根据本发明，提供了在靶位点进行重组的方法，该方法包括：
[0013] -提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的 序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；和（C)编码识别位点特异性重组位点的重组 酶的序列，
[0014] 其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，并且
[0015] 其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序 列；以及
[0016] -使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点 插入编码有功能重组酶的连续核酸序列，所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特 异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组 的序列。
[0017] 附图简沐
[0018] 图1阐述了通过直接整合的ICLl移除以及分开的ere重组酶（split-cre recombinase)构建体的体内重组的原理。Cre-重组酶的表达受到GALl启动子的调控。
[0019] 图 2 阐述了 pMA Cre-I 和 pMA Cre-2(pSUC225)的质粒图。pMA Cre-I 包含 1οχ66 位点，GALl启动子和失活的Cre重组酶开放阅读框5'部分，pSUC225包含Cre重组酶开放 阅读框的3'失活部分、CYCl终止子和1οχ71位点。
[0020] 图3阐述了 pSUC227的质粒图。所述质粒包含1οχ66位点，kanMX标记盒，GALl启 动子和失活的Cre重组酶开放阅读框5'部分。
[0021] 图4阐述了利用引物对DBC-03670和DBC-03761扩增ICLl基因的基因组位点的 PCR反应，在野生型情况下产生3449bp PCR片段，和在标记被1οχ66和1οχ71的重组移除的 KO情况下产生1812bp PCR片段。
[0022] 图5阐述了质粒pEPO-US的示意图，其包含用于失活在A. niger和E. coli质粒 DNA中的印〇基因的置换盒的部分。该置换盒包含用于靶向的印〇侧翼区域，突变IoxP位 点，功能性hygB标记盒和可诱导的ere重组酶表达盒。更多pEPO-US的细节可以在实施例 部分找到（见下）。
[0023] 图6阐述了质粒EPO-DS的示意图，其包含用于失活在A. niger和E. coli质粒DNA 中的epo基因的置换盒的部分。该置换盒包含用于靶向的epo侧翼区域，ere重组酶表达 盒，突变IoxP位点。更多EPO-DS的细节可以在实施例部分找到（见下）。
[0024] 图7阐述了 5'分开的CRE片段和3'分开的CRE片段的片段产生以及如何在 A. niger的转化和靶向重组中使用这些重叠的片段的可行设计的示意图。上图表示待靶向 基因的基因组DNA组成。中间图显示通过PCR扩增的" 5 '分开的CRE "和" 3 '分开的CRE " 片段的生成。下图显示通过基因组中5'分开的CRE和3'分开的CRE的同源重组的A. niger 转化。
[0025] 序列表描沐
[0026] SEQ ID NO :1阐述了 Cre-I合成片段的核酸序列。
[0027] SEQ ID NO :2阐述了 Cre-2合成片段的核酸序列。
[0028] SEQ ID NO :3阐述了 pMA Crel完全的核酸序列。
[0029] SEQ ID NO :4 阐述了 pMA Cre2(pSUC225)完全的核酸序列。
[0030] SEQ ID NO :5阐述了 pUG7-EcoRV完全的核酸序列。
[0031] SEQ ID NO :6阐述了引物DBC-02738的核酸序列。
[0032] SEQ ID NO :7阐述了引物DBC-02739的核酸序列。
[0033] SEQ ID NO :8阐述了带有kanMX标记PCR片段的pCR-Blunt II-TOPO载体的核酸 序列。
[0034] SEQ ID NO :9 阐述了 pSUC227 的核酸序列。
[0035] SEQ ID NO : 10阐述了 ICLl基因上游的5'侧翼片段的核酸序列。
[0036] SEQ ID NO :11阐述了引物DBC-03754的核酸序列。
[0037] SEQ ID NO :12阐述了引物DBC-03755的核酸序列。
[0038] SEQ ID NO : 13阐述了 ICLl基因下游的3'侧翼片段的核酸序列。
[0039] SEQ ID NO :14阐述了引物DBC-03758的核酸序列。
[0040] SEQ ID NO :15阐述了引物DBC-03759的核酸序列。
[0041] SEQ ID NO :16 阐述了 "Cre-1-kanMX" 片段的核酸序列。
[0042] SEQ ID NO :17阐述了引物DBC-03756的核酸序列。
[0043] SEQ ID NO :18阐述了引物DBC-03373的核酸序列。
[0044] SEQ ID NO : 19阐述了 Cre-2片段的核酸序列。
[0045] SEQ ID NO :20阐述了引物DBC-03374的核酸序列。
[0046] SEQ ID NO :21阐述了引物DBC-03757的核酸序列。
[0047] SEQ ID NO :22阐述了引物DBC-03760的核酸序列。
[0048] SEQ ID NO :23阐述了引物DBC-03761的核酸序列。
[0049] SEQ ID NO :24阐述了 DBC-03760和DBC-03761野生型ICLl的产物的核酸序列。
[0050] SEQ ID NO :25 阐述了 DBC-03760 和 DBC-03761 ICLl 缺失和 kanMX 标记和 Cre 重 组酶外重组的产物的核酸序列。
[0051] SEQ ID NO :26阐述了引物DBC-07072和引物DBC-08586的产物的核酸序列。
[0052] SEQ ID NO :27阐述了引物DBC-08585和引物DBC-04415的产物的核酸序列。
[0053] SEQ ID NO :28阐述了引物DBC-07072的核酸序列。
[0054] SEQ ID NO :29阐述了引物DBC-08586的核酸序列。
[0055] SEQ ID NO :30阐述了引物DBC-08585的核酸序列。
[0056] SEQ ID NO :31阐述了引物DBC-04415的核酸序列。
[0057] 发明详沐
[0058] 在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语"包括"、"包含"和"具有"应被解释为 包括性的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在表达可能包括未明确指出的其他要素 或整体。
[0059] 不使用数量词时表示一个或多于一个（即一个或至少一个）的客体。例如，"要素" 可表示一个要素或多于一个要素。
[0060] 根据本发明所述的方法被用于在靶位点实施重组。重组指的是核酸的分子被打断 然后被连上不同核酸分子的过程。本发明的重组过程典型地涉及人工和有目的地重组不同 核酸分子（其可来自于相同或不同生物体）以创造重组的核酸。
[0061] 术语"重组"的意思是，例如核酸序列是通过人工组合两种否则分开的序列区段 (例如通过化学合成或通过用基因工程技术处理分离的核酸）得到的。
[0062] 本发明所述的方法依赖于同源重组和位点特异性重组的结合。
[0063] "同源重组"指的是具有包含相似核苷酸序列的对应位点的核苷酸序列（即同源序 列）之间的反应，通过所述反应分子能够相互作用（重组）以形成新的、重组的核酸序列。 相似核苷酸序列的位点在本文中被分别称为"同源序列"。典型地，同源重组的频率随着同 源序列的长度的增加而增加。因此，虽然同源重组能够在不完全相同的两种核酸序列之间 发生，但随着两种序列之间的差异的增加，重组频率（或效率）下降。可使用将被结合的两 种分子的每一种上的一种同源序列以实现重组，从而产生"单交换"的重组产物。或者，两 种同源序列可被放置将被重组的两种分子的每一种上。供体上的两种同源序列和靶标上的 两种同源序列之间的重组产生"双交换"的重组产物。
[0064] 如果供体分子上的同源序列的侧翼是将被操作的序列（例如感兴趣的序列），那 么与靶分子的双交换重组将产生这样的重组的产物，其中感兴趣的序列置换本来位于靶分 子上的同源序列之间的DNA序列。
[0065] "位点特异性重组"（也被称为保守的位点特异性重组）是核酸链的交换发生在仅 具有有限程度的序列同源性的区段之间的一类重组。位点特异性重组酶识别和结合短DNA 序列（位点），在此处切割DNA骨架、交换参与的两种DNA螺旋并重新连接DNA链，从而使核 酸区段重新排列。在一些位点特异性重组系统中，仅仅具有重组酶连同重组位点就足以执 行所有这些反应；在另一些系统中，可能还需要一些辅助蛋白和辅助位点。
[0066] 所述方法可被用于在靶位点实施重组以导致靶位点的修饰。因此，本发明可被用 于添加、缺失或以另外的方式改变靶位点。靶位点可以是编码序列或非编码序列。可利用本 发明所述的方法以使这种编码或非编码序列可被破坏和/或部分或完全缺失和/或置换。 因此，本发明所述的方法可被用于置换靶位点的序列，例如用编码标记的序列。
[0067] 典型地，在宿主细胞（例如微生物的细胞）体内实施本发明。优选地，宿主细胞可 产生感兴趣的化合物。所述宿主细胞可以在应用本发明所述的方法之前能够产生感兴趣的 化合物。在这种情况下，本发明所述的方法可被用于修饰靶位点以使所述宿主细胞的感兴 趣的化合物的生产改变，例如可以增加产量。或者，所述宿主细胞可以由于应用本发明所述 的方法而产生感兴趣的化合物。
[0068] 因此，本发明可被用于，例如最优化宿主细胞的生产力和/或使用它们的工艺。或 者，本发明可被用以，例如引入新的核酸以使宿主细胞能够产生感兴趣的新化合物。本发明 可被连续使用以引入多个新的核酸序列至宿主细胞，从而引入全新的通路代谢通路。
[0069] 靶位点可以是待修饰的任何核酸序列。典型地，靶位点可以是基因组（生物体的 完整遗传物质）内的序列，例如染色体上的位点。这种染色体可以是线型或环形的染色体。 然而，靶位点可以在染色体外，例如质粒、微型染色体或人工染色体上的位点。靶位点可以 位于质粒、噬菌体或任何其它能够在体外或在宿主细胞中复制或者被复制的核酸序列。
[0070] 本发明的方法可以在体外，离体或体内进行。
[0071] 本发明的方法包括：
[0072] -提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的 序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；和（C)编码识别位点特异性重组位点的重组 酶的序列，
[0073] 其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，并且
[0074] 其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序 列；以及
[0075] -使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点 插入编码有功能重组酶的连续核酸序列，所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特 异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组 的序