一种具有抗衰老活性的rg-i型枸杞果胶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种具有抗衰老活性的RG-I型构杞果胶的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 构杞子为构杞的干燥成熟果实，系茄科（Solanaceae)、茄族（SolanceaeReitib)、 构杞亚族化yciinaeWettst)、构杞属L.)，最负盛名的是宁夏构杞曲 L.)。构杞子是我国的传统名贵中药材，它在我国传统医学中具有重要的地位，其 药用价值备受历代医家的推崇。
[0003] 现代药理学研究表明，构杞子的药理和保健作用与其中含有的生物活性物质构杞 多糖（心心扣曲知'知'歴polysaccharide,LBP)有很大关系，是构杞调节免疫、延缓衰老的 主要活性成分，可改善老年人易疲劳、食欲不振和视力模糊等症状，并具有降血脂、抗脂肪 肝、抗衰老等功效(殷現琪等，2012)。鉴于构杞的诸多功效与抗氧化有关，构杞多糖抗氧化 作用研究已成为国内外天然产物领域研究的热点。
[0004] 在屯、血管疾病产生方面，氧化与抗氧化的失衡会引起屯、血管系统的病变，如动脉 粥样硬化、高血压、屯、脏病、屯、肌缺血等，而该些病变也会加剧机体W及组织的氧化应激水 平。实验证明，构杞多糖具有抗氧化应激的功效，可W防止高血脂引发的动脉粥样硬化(李 燈洪等，2010 ;刘新岩等，2011 ;姜清茹等，2011 ;周国亮等，2011)。在肝脏氧化损伤防护方 面，构杞多糖不仅可W显著抑制高脂饲料造成的氧化性肝损伤，还可W通过清除体内氧自 由基、提高内源性抗氧化酶活力、抑制脂质过氧化等途径，减低小鼠血液和肝脏中铅的含量 (WuHTetal.，2010)。在神经系统损伤保护方面，构杞多糖能够对氧化应激诱导的II型 糖尿病大鼠周围神经细胞调亡具有保护作用（吴庆秋，2010)。在内分泌系统氧化损伤保护 方面，构杞多糖可W通过抑制自由基产生、清除已产生的自由基、提高抗氧化酶活力等途径 显著改善高血糖状况下因多元醇代谢的亢进、葡萄糖的自身氧化而造成的血管内皮细胞结 构和功能损伤(余小平等，2011)。在抗衰老方面，根据自由基伤害理论，自由基过量产生是 导致皮肤自然衰老和光老化的主要原因。构杞多糖能够通过抑制自由基产生、清除已产生 的自由基、提高抗氧化酶活力等途径，减轻皮肤组织氧化损伤，降低皮肤癌的发病几率，有 效延缓皮肤衰老，并与维生素E有良好的协同作用（李响等，2009 ;王发选等，2011 )。
[0005] 目前研究人员已经从构杞子中提取、分离纯化得到多种结构类型的多糖成分， 包括糖蛋白化GP(分子量88kDa，糖含量70%，单糖为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖，其摩尔 比为2. 5:1. 0:1. 0)、LBPNP(单糖组成为木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、赤薛糖 及少量岩藻糖和山梨糖，前5种糖基摩尔比为10:1:1:6. 7:4)、化p3 (分子量92. 5kDa， 单糖组成为阿拉伯糖和葡萄糖，其摩尔比为1:1)、化p4 (分子量214.8kDa，单糖组成 为阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖，其摩尔比为1.5:2. 50.43:0. 23)、化p5 (分子 量23.7kDa，单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖，其摩尔比为 0.33:0. 52:0. 42:0. 94:0. 85:1)、LBPC4 (分子量lOkDa，a-1,4-1，6 连接的葡聚糖肤)、杂 多糖肤化8口43、1^8口81、1^8口〔2，分子量分别为661^)3，181^)3，121^)3，均为0-1，4-1，6连接） 和阿拉伯半乳聚糖（AGP)。
[0006] 为了得到高抗氧化活性的构杞多糖，研究人员对构杞多糖的提取工艺进行了优化 研究。刘凌等（2009)对提取纯化工艺对构杞多糖抗氧化功能的影响进行了研究。结果表 明，样品体外抗氧化能力强弱关系为构杞多糖II(脱蛋白、脱寡糖、脱脂)〉构杞多糖I(脱寡 糖、脱脂)〉构杞粗多糖。构杞多糖II在0. 2~Img/mL时，其DPPH自由基清除能力达到85%， 相比构杞粗多糖提高1~8倍。张民等（2012)研究建立了超细粉碎辅助提取构杞多糖的工 艺技术，并初步探讨了超细粉碎对构杞多糖结构及抗氧化活性的影响。结果表明，采用超细 粉碎技术，构杞多糖的提取率可W达到4. 0 + 0. 13%，比常规粉碎法提高了 15.6%。超细粉碎 后构杞多糖在2~lOmg/mL范围内，DPPH自由基清除率为20. 65%~76. 07%，比常规粉碎法得到 的构杞多糖提高了 48 . 459(^55. 21%。中国发明专利"一种高抗氧化活性构杞多糖的制备方 法"（CN102936292A)，在制备过程中构杞子经超细粉碎前处理、己醇前处理、水提取、真空 浓缩、己醇沉淀、蛋白质脱除、己醇分级沉淀处理制备得到高抗氧化活性构杞多糖。与未经 超细粉碎前处理的构杞多糖比较，该方法所获得的构杞多糖对DPPH自由基的半数抑制浓 度（IQ。）降低60%W上，对ABTS自由基的IQ。值降低70%W上。
[0007] 目前，提高构杞多糖抗氧化活性的制备方法还只是针对多糖提取和除杂过程，并 未设及活性多糖组分的进一步分离纯化，因此不找到抗氧化活性中屯、，很难从根本上提高 构杞多糖的抗氧化能力。但是，到现在为止，还没有关于构杞多糖抗氧化活性中屯、及其分离 纯化方法的专利和报道。
【发明内容】
[000引本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的具有抗衰老活性的RG-I型构杞果胶的制备方法。
[0009] 为解决上述问题，本发明所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型构杞果胶的制备 方法，包括W下步骤： 山将构杞加水经微波-超声波协同提取，得到提取液，该提取液经过滤去除沉淀，收集 滤液；所述滤液在温度为60~80°C的条件下浓缩至所述滤液体积的1/6~1/8后，得到浓缩 液； 口)所述浓缩液中加入其体积3~4倍的无水己醇，混匀后4°C~10°C静置12~2化，经离屯、 得到沉淀产物； 樹所述沉淀产物按1 ;6~10的质量体积比加水复溶后，经离屯、除杂，得到上清液，该上 清液于-7〇°C~ -85°C预冻4~化后经冷冻干燥，即得构杞多糖； W将DEAE-纤维素按常规方法依次用0. 5~1mol/L肥1和0. 5~1mol/L化0H水溶液 处理为助T型后装入阴离子交换柱，所述构杞多糖上样进行柱层析分离后，依次用2~3倍柱 体积的蒸馈水和0.5mol/L化C1水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液 A;所述洗脱液A依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到构杞中性多糖LBP-N和构杞酸性多糖 LBP-A； 脚所述构杞酸性多糖LBP-A经Se地arose化-她凝胶过滤柱层析分离后，依次用1~1. 5 倍柱体积的0. 05~0. 5mol/L化C1水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液 B;所述洗脱液B依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到构杞酸性多糖LBP-A-1和构杞酸性多 糖LBP-A-2 ; 做所述构杞酸性多糖LBP-A-1经DEAE-Se地a巧seFastFlow阴离子交换柱层析纯化 后，依次用3~5倍柱体积的0~0. 5mol/L化C1水溶液连续梯度洗脱，并根据洗脱液糖含量 分布曲线，收集洗脱液C;所述洗脱液C依次经透析除盐、冷冻干燥，即得抗衰老活性RG-I 型构杞果胶纯品。
[0010] 所述步骤(1)中的构杞为宁夏构杞Z.)的成熟果实。
[0011] 所述步骤(1)中的微波-超声波协同提取条件是指料液质量体积比为1 ;1〇~20,提 取温度为60~100°C，超声波功率600~800W，微波功率340~380W，提取总时间为20~30min。
[0012] 所述步骤脚和所述步骤樹中的离屯、条件均是指转速为4000rpm~5000rpm，时间为 15min~20min。
[0013] 所述步骤樹、所述步骤(4)、所述步骤脚、所述步骤做中冷冻干燥的条件均是指真空 度为10~100Pa、温度为-55°C~ -70°C、干燥时间为24~72ho
[0014] 所述步骤(4)中DEAE-纤维素柱层析分离的条件是指色谱柱直径10~30cm、长度 50~100cm，流动相依次为蒸馈水和0. 5mol/L化C1，流速为20~40cm/h。
[0015] 所述步骤(4)、所述步骤脚、所述步骤做中透析除盐的条件均是指透析袋截留分子 量500~3500化，蒸馈水中透析24~4她。
[0016] 所述步骤脚中Se地arose化-6B凝胶过滤柱层析分离的条件是指色谱柱直径 1~5畑1、长度80~120畑1，流动相为0. 05~0. 5mol/L化C1水溶液，流速为10~20cm/h。
[0017] 所述步骤做中DEAE-Se地a巧seFastFlow阴离子交换柱层析纯化的条件是指色 谱柱直径5~10畑1、长度40~70畑1，用3~5倍柱体积的0~0. 5mol/L化C1水溶液连续梯度洗 脱，流速为15~30cm/h。
[001引本发明与现有技术相比具有W下优点： 1、本发明W高原珍稀药用植物构杞果实为原料，利用低功率微波穿透式内外加热，在 降低活性多糖结构破坏风险的同时促进多糖溶出、节省提取时间，而且利用超声波的空化 效应，进一步提高活性多糖的微波提取效率，同时降低了能耗和污染物排放，具有工业化生 产的实际意义。
[0019] 2、本发明应用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析(参