一种大丽轮枝菌菌种保藏方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病原真菌学研宄领域，具体涉及一种大丽轮枝菌菌种保藏方法。
【背景技术】
[0002]植物病原性轮枝菌是指能够造成植物病害、利用柯赫法则可以加以鉴定的一类可培养轮枝菌属真菌病原物。轮枝菌属(Verticillium)由Nees在1817年建立，能够腐生或寄生在昆虫、线虫、真菌和植物上。其中危害植物的种类主要包括黑白轮枝菌VerticiUiunialbo-atrum Reinke and BertholcU 大刚轮枝菌 V.dahliae Klebahn、三体轮枝菌 V.tri corpus Isaac、云状轮枝菌 V.nub Hum Pethybridge 和 V.theobromae (Turconi)Mason and Hughes等植物病原性轮枝菌，它们均可造成植物病害的发生，其中以同为土壤习居菌的大丽轮枝菌和黑白轮枝菌危害为最，属于我国重要植物检疫对象。对植物病原性轮枝菌真菌进行鉴定和后续研宄，一般首先要进行分离保存工作，分离的真菌采用适当方法保存，能够保持它的生活力、原有培养性状和致病性，并避免杂菌和螨类等的污染，为后续工作提供重要保证。传统上，轮枝菌种类鉴定的主要依据是微菌核、厚垣孢子、休眠菌丝的有无等。一般认为黑白轮枝菌仅能产生黑色的休眠菌丝，大丽轮枝菌能产生微菌核却不产生休眠菌丝，三体轮枝菌可以同时产生黑色的休眠菌丝、微菌核及厚垣孢子，云状轮枝菌只产生厚垣孢子等。然而，不同轮枝菌常因保存条件的影响而发生变异，如保存方式不同和保存时间不同等，其形态变异主要表现为菌落形态的改变和产休眠结构能力的丧失等，这对于轮枝菌相关研宄带来了极大不便。
[0003]植物病原性轮枝菌常用保存方法主要包括定期移植保藏法、液氮超低温保藏法、冷冻干燥保藏法、-80°C低温冻结保藏法等。定期移植保藏法是常用保存方法，如PDA试管斜面保存即属于此类方法，但该方法保存菌种发生变异可能性较大，且容易受到螨类污染。液氮超低温保藏法适用于绝大多数可以纯培养的丝状真菌的长期保藏，可完全抑制真菌代谢活动，但是需要不间断使用液氮和一定保存设施，操作繁琐，费用较高。冷冻干燥保藏法的原理是使微生物快速冷冻后通过升华作用将水分除去，该方法所需设备较多，步骤较多。_80°C低温冻结保藏法同样需要超低温冰箱设备进行保存，能够保持较长时间真菌活性，但是要注意日常冰箱维护保养工作，否则极易造成菌种活性丧失，且需配置一定保护剂进行配合使用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种大丽轮枝菌菌种保藏方法，该方法操作简单，设备依赖性低，保存期长，费用低廉，占用存储空间少，不会对病菌致病性以及形态特征造成影响，一般实验室均可满足其条件，便于应用和推广。
[0005]本发明所要解决的技术问题是一种大丽轮枝菌菌种保藏方法，步骤如下: a、取待保存大丽轮枝菌菌株在PDA培养基上培养5~10天，形成可保存菌落；
1^、将1.2 mL灭菌双蒸水加入直径1.2 cm、高度5 cm的圆柱状带螺帽冻存管中，轻轻拧住螺帽，放入纸质冻存盒中；
C、将装有冻存管的冻存盒放入水蒸气灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121 °0高压灭菌20 min，重复灭菌2次；
d、用解剖刀将上述可保存菌落连同PDA培养基切割成为直径约3.5-4.5 mm的菌种块，取菌种块4~8块放入灭菌好的冻存管中，拧紧冻存管螺帽；
e、上下晃动冻存管，使所有菌种块浸没入灭菌双蒸水中；
f、用记号笔在冻存管上标记好所保存大丽轮枝菌菌株编号，将其放入冻存盒中，冻存盒在4 °0冷藏箱内保存。
[0006]g、需用时，用挑针挑取带有大丽轮枝菌的PDA小块，置于PDA上活化培养。
[0007]与现有技术相比本发明的优点在于一种大丽轮枝菌菌种保藏方法，该方法通过以灭菌双蒸水作为保存液体，配合冻存管和普通冷藏箱的使用，能够很好的保持所保存大丽轮枝菌菌株的生活力和原有性状，并避免了杂菌和螨类的污染，节省了保存体积，操作十分简单，对设备依赖性低，保存期可达3年以上，无需进行繁琐的转管保存等操作，所使用冻存管、灭菌双蒸水等原材料费用低廉，一般实验室均可满足该方法所需条件，便于大范围应用和推广。
【具体实施方式】
[0008]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0009]实施例1
1、通过在PDA平板上培养大丽轮枝菌菌株V12 10天，获得V12的纯培养PDA平板；2、将1.2 mL灭菌双蒸水加入直径1.2 cm,高度5 cm的圆柱状带螺帽冻存管中，轻轻拧住螺帽，放入纸质冻存盒中；3、将装有冻存管的冻存盒放入灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121°〇高压灭菌20 min，重复灭菌2次；4、用解剖刀将培养好V12菌落连同PDA培养基切割成为直径约4 mm左右(3.5-4.5 mm)的菌种块，取4~8块菌种块放入灭菌好的冻存管中，拧紧冻存管螺帽；5、上下晃动冻存管，使所有放入V12菌株PDA小方块浸没入灭菌双蒸水中；6、用记号笔在冻存管上标记好所保存V12的编号，将其放入冻存盒中；7、将冻存盒放入4 °〇冷藏箱中，进行长期保存；8、需用时，用挑针挑取带有V12的PDA小块，置于PDA上活化培养。
[0010]上述大丽轮枝菌菌种保藏方法也可应用于黑白轮枝菌、三体轮枝菌、云状轮枝菌等，在此不一一列举。
【主权项】
1.一种大丽轮枝菌菌种保藏方法，其特征在于步骤如下: a、取待保存大丽轮枝菌菌株在PDA培养基上培养5~10天，形成可保存菌落； b、将1.2 mL灭菌双蒸水加入直径1.2 cm、高度5 cm的圆柱状带螺帽冻存管中，轻轻拧住螺帽，放入纸质冻存盒中； c、将装有冻存管的冻存盒放入水蒸气灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121°0高压灭菌.20 min，重复灭菌2次； d、用解剖刀将上述可保存菌落连同PDA培养基切割成为直径约3.5-4.5 mm的菌种块，取4~8块菌种块放入灭菌好的冻存管中，拧紧冻存管螺帽； e、上下晃动冻存管，使所有菌种块浸没入灭菌双蒸水中； f、用记号笔在冻存管上标记好所保存大丽轮枝菌菌株编号，将其放入冻存盒中，冻存盒在4 °0冷藏箱内保存。
【专利摘要】本发明公开了一种大丽轮枝菌菌种保藏方法，该方法通过以灭菌双蒸水作为保存液体，配合冻存管和普通冷藏箱的使用，能够很好的保持所保存大丽轮枝菌菌株的生活力和原有性状，并避免了杂菌和螨类的污染，节省了保存体积，操作十分简单，对设备依赖性低，保存期可达3年以上，无需进行繁琐的转管保存等操作，所使用冻存管、灭菌双蒸水等原材料费用低廉，一般实验室均可满足该方法所需条件，便于大范围应用和推广。
【IPC分类】C12N1/04, C12R1/645
【公开号】CN104988064
【申请号】CN201510351278
【发明人】段维军, 蔡磊, 郭立新, 段丽君, 陈先锋
【申请人】宁波检验检疫科学技术研究院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月24日