一种sd大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离和培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离和 培养方法。
【背景技术】
[0002] 动脉血管平滑肌细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维 持血管收缩，抗凝血等方面起重要作用。此方法的运用和发展为研究某些屯、血管疾病的发 病机制及其防治工作提供了重要的研究手段。但是现有的分离方法并不成熟，不仅分离获 得细胞数少，而且材料利用度低，操作麻烦。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离和培养方法，不仅 大大提高分离获得的细胞数，还提高了材料的利用度，操作简便。
[0004] 本发明为解决上述问题所采取的技术方案是；一种SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的分离和培养方法，包括W下步骤： 1) 选取重为100-150g的SD大鼠，在无菌条件下切取SD大鼠的胸主动脉并除去血污， 备用； 2) 把胸主动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，再将胸主动脉沿纵向剪 开，并除去血管外的脂肪及结缔组织，然后把胸主动脉放入质量浓度为2g/L的胶原酶 II中浸泡20~30min,备用； 3) 取出步骤2)处理过的胸主动脉，除去胸主动脉上的外膜，备用； 4) 将步骤3)处理过的胸主动脉放入消化液中，并转入温度为37 °C、C〇2体积浓度为 5%的培养箱中解育2h，再放入胎牛血清质量浓度为20%的DMEM培养基中，备用； 5) 将步骤4)处理过的胸主动脉放入转速为1500巧m的离屯、机中离屯、5min,收集沉淀 物得到胸主动脉平滑肌细胞，将胸主动脉平滑肌细胞放入胎牛血清质量浓度为20%的DMEM 培养瓶中，之后转入温度为37 °C、C〇2体积浓度为5%的培养箱中培养，之后进行传代培养 即可。
[0005] 进一步优化，步骤4)所述的消化液由胶原酶n和弹性蛋白酶按8:1的重量比混合 而成。
[0006] 所述SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的传代方法，包括W下步骤： A、 把SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞放入无菌PBS溶液中清洗2-3次，再将SD大鼠胸主 动脉平滑肌细胞转入复合消化液中，待胸主动脉平滑肌细胞变圆后弃去消化液，并加入胎 牛血清W终止消化反应，备用； B、 将步骤A处理的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞转移到无菌离屯、管中，在转速为 1500巧m的离屯、机中离屯、3min，除去上清液后，将沉淀加入到血清质量百分比浓度为10%的 DMHM培基中培养即可。
[0007] 进一步优化，步骤A所述的复合消化液由膜酶和邸TA按1. 25:2的重量比混合而 成。
[0008] 有益效果 本发明旨在建立一种简单、高效分离培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞的方法。本方法选 用SD大鼠作为胸主动脉平滑肌细胞的来源，不仅取材方便，获得细胞数多，且采用用II型 胶原酶和弹性蛋白酶联合消化血管中层的方法，材料利用度高，经济实用，简便易行，有利 于获得所需的体外实验模型细胞。此外，本发明还具有W下显著优点；明显缩短消化及培养 时间；收获的细胞数量多，且对细胞膜的损害程度轻；细胞纯度高，同时能够更好地保护 离体细胞的性状和代谢。
【附图说明】
[0009] 图1为不同浓度、时间&〇2作用图； 图2为不同时间、100ymol/L&化作用与细胞调亡。
【具体实施方式】
[0010] 一种SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离和培养方法，包括W下步骤： 1) 选取重为100-150g的SD大鼠，在无菌条件下切取SD大鼠的胸主动脉并除去血污， 备用； 2) 把胸主动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，再将胸主动脉沿纵向剪开， 并除去血管外的脂肪及结缔组织，然后把胸主动脉放入质量浓度为2g/L的胶原酶n中浸 泡20~30min,备用； 3) 取出步骤2)处理过的胸主动脉，除去胸主动脉上的外膜，备用； 4) 将步骤3)处理过的胸主动脉放入消化液中，并转入温度为37 °C、C〇2体积浓度为 5%的培养箱中解育2h，再放入胎牛血清质量浓度为20%的DMEM培养基中，备用； 5) 将步骤4)处理过的胸主动脉放入转速为1500巧m的离屯、机中离屯、5min,收集沉淀 物得到胸主动脉平滑肌细胞，将胸主动脉平滑肌细胞放入胎牛血清质量浓度为20%的DMEM 培养瓶中，之后转入温度为37 °C、C〇2体积浓度为5%的培养箱中培养，之后进行传代培养 即可。
[0011] 所述SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的传代方法，包括了W下步骤： A、 把SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞放入无菌PBS溶液中清洗2-3次，再将SD大鼠胸主 动脉平滑肌细胞转入复合消化液中，待胸主动脉平滑肌细胞变圆后弃去消化液，并加入胎 牛血清W终止消化反应，备用； B、 将步骤A处理的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞转移到无菌离屯、管中，在转速为 1500巧m的离屯、机中离屯、3min，除去上清液后，将沉淀加入到血清质量百分比浓度为10%的 DMHM培基中培养即可。
[0012] 步骤4)所述的消化液由胶原酶n和弹性蛋白酶按8:1的重量比混合而成。
[0013] 步骤A所述的符合消化液由膜酶和邸TA按1. 25:2的重量比混合而成。
[0014] 实施例1 一种SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离和培养方法，包括W下步骤： 1) 选取重为100-150g的SD大鼠，在无菌条件下切取SD大鼠的胸主动脉并除去血污， 备用； 2) 把胸主动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，再将胸主动脉沿纵向剪开， 并除去血管外的脂肪及结缔组织，然后把胸主动脉放入质量浓度为2g/L的胶原酶n中浸 泡20min,备用； 3) 取出步骤2)处理过的胸主动脉，除去胸主动脉上的外膜，备用； 4) 将步骤3)处理过的胸主动脉放入消化液中，并转入温度为37 °C、C〇2体积浓度为 5%的培养箱中解育2h，再放入胎牛血清质量浓度为20%的DMEM培养基中，备用； 5) 将步骤4)处理过的胸主动脉放入转速为1500巧m的离屯、机中离屯、5min,收集沉淀 物得到胸主动脉平滑肌细胞，将胸主动脉平滑肌细胞放入胎牛血清质量浓度为20%的DMEM 培养瓶中，之后转入温度为37 °C、C〇2体积浓度为5%的培养箱中培养，之后进行传代培养 即可。
[0015] 步骤4)所述的消化液由胶原酶II和弹性蛋白酶按8:1的重量比混合而成。
[0016] 所述SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的传代方法，包括了W下步骤： A、 把SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞放入无菌PBS溶液中清洗2-3次，再将SD大鼠胸主 动脉平滑肌细胞转入复合消化液中，待胸主动脉平滑肌细胞变圆后弃去消化液，并加入胎 牛血清W终止消化反应，备用； B、 将步骤A处理的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞转移到无菌离屯、管中，在转速为 1500rpm的离屯、机中离屯、3min，除去上清液后，将沉淀加入到血清质量百分比浓度为10%的 DMHM培基中培养即可。
[0017] 步骤A所述的符合消化液由膜酶和邸TA按1. 25:2的重量比混合而成。
[001引 实施例2 一种SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离和培养方法，包括W下步骤： 1) 选取重为100-150g的SD大鼠，在无菌条件下切取SD大鼠的胸主动脉并除去血污， 备用； 2) 把胸主动脉切割成长为3-5cm的长段后放入PBS溶液中，再将胸主动脉沿纵向剪开， 并除去血管外的脂肪及结缔组织，然后把胸主动脉放入质量浓度为2g/L的胶原酶n中浸 泡30min,备用； 3) 取出步骤2)处理过的胸主动脉，除去胸主动脉上的外膜，备用； 4) 将步骤3)处理过的胸主动脉放入消化液中，并转入温度为37 °C、C02体积浓度为 5%的培养箱中解育2h，再放入胎牛血清质量浓度为20%的DMEM培养基中，备用； 5) 将步骤4)处理过的胸主动脉放入转速为1500巧m的离屯、机中离屯、5min,收集沉淀 物得到胸主动脉平滑肌细胞，将胸主动脉平滑肌细胞放入胎牛血清质量浓度为20%的DMEM 培养瓶中，之后转入温度为37 °C、C02体积浓度为5%的培养箱中培养，之后进行传代培养 即可。
[0019] 步骤4)所述的消化液由胶原酶II和弹性蛋白酶按8:1的重量比混合而成。
[0020] 所述SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞的传代方法，包括了W下步骤： A、把SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞放入无菌PBS溶液中清洗2-3次，再将SD大鼠胸主 动脉平滑肌细胞转入复合消化液中，待胸主动脉平滑肌细胞变圆后弃去消化液，并加入胎 牛血清w终止消化反应，备用； B、将步骤A处理的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞转移到无菌离屯、管中，在转速为 1500rpm的离屯、机中离屯、3min，除去上清液后，将沉淀加入到血清质量百分比浓度为10%的 DMHM培基中培养即可。
[0021] 步骤A所述的符合消化液由膜酶和邸TA按1. 25:2的重量比混合而成。
[0022] 试验例1 1)无菌条件下取100-150gSD大鼠胸主动脉，并在PBS缓冲液中洗去血污。将动脉切 成3~5cm长的小段，然后再将血管